[发明专利]马铃薯中T-2毒素的提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及T-2毒素的提取方法，尤其涉及马铃薯中T-2毒素的提取方法，属于T-2毒素的检测领域。

背景技术

干腐病是影响马铃薯贮藏质量的一种真菌病害，其主要致病菌为镰刀菌。由于窖藏过程中窖温高，湿度大，镰刀菌侵染的薯块会出现腐烂变质导致“烂窖”，对中国的马铃薯产业造成了巨大的经济损失。在镰刀菌侵染马铃薯的同时，还会产生大量的单端孢霉烯族毒素如T-2毒素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON，即呕吐毒素)、蛇形霉素(DAS)等，其中T-2毒素主要影响血液、肝脏、肾脏、胰腺肌肉及淋巴细胞的功能，人和家畜若误食则会导致厌食、呕吐、腹泻、生长停滞、繁殖和神经机能障碍，甚至死亡。

因此，开发一种新的马铃薯中T-2毒素的提取方法，对于实现马铃薯干腐病中的T-2毒素的准确检测显得尤为重要。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种马铃薯中T-2毒素的提取方法，该方法操作简便、T-2毒素的提取率高。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

本发明公开了一种马铃薯中T-2毒素的提取方法，包括以下步骤：将马铃薯粉碎，加入样品提取液，震荡，离心，取上清液，即得。

本发明中离心后向上清液中加入稀释液进行稀释，即可用于ELISA检测。其中，上清液与稀释液的体积比为1：5；所述稀释液为甲醇和水按照体积比10：90组成的混合液。

本发明马铃薯中T-2毒素的提取方法，按照g/ml计，马铃薯与样品提取液的比例为1：10-30；优选为1：20。

所述样品提取液为甲醇和水按照体积比20-80：20-80组成的混合液；优选为甲醇和水按照体积比50-80：20-50组成的混合液；最优选为甲醇和水按照体积比60：40组成的混合液。

本发明对样品提取液中甲醇的浓度进行了优化实验，甲醇浓度(即样品提取液中甲醇的体积百分比)分别为10％、20％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、80％，50rpm震荡3min，3000rpm离心3min，然后进行ELISA检测。结果表明，随着甲醇浓度的提高，T-2毒素的提取量提高；当采用60％的甲醇溶液提取，针对6种不同的镰刀菌都具有最高的提取量；继续提高甲醇浓度，T-2毒素的提取量开始下降。其中，针对1-6号镰刀菌，采用60％甲醇溶液提取，T-2毒素的提取量分别比55％甲醇浓度的处理提高40％-146.2％。因此，本发明选择60％甲醇溶液为样品提取液，即甲醇和水按照体积比60：40组成的混合液。

本发明所述震荡的转数为50-200rpm，震荡的时间为3-10min；优选的，所述震荡的转数为150rpm，震荡的时间为5min。所述离心的转数为3000-4500rpm，离心的时间为3-10min；优选的，所述离心的转数为4000rpm，离心的时间为5min。

本发明在确定了样品提取液的基础上，为了提高毒素的获得量，进一步对震荡的转数和震荡时间进行优化，震荡的转数分别为50、100、150、200rpm，时间分别为3、5、8、10min。结果表明，优化震荡处理可以显著提高毒素的提取率，震荡转数150rpm条件下，1-6号菌的T-2毒素的提取量均高与其他转数；其中，在震荡转数为150rpm，震荡时间为5min条件下，6种不同的镰刀菌T-2毒素的提取量均最高；与震荡转数150rpm，时间3min条件下相比，1-6号菌的T-2毒素提取量分别提高了7％-21.4％；继续延长震荡时间，1-6号菌的T-2毒素提取量开始下降。因此，本发明选择震荡转数150rpm，震荡时间为5min。

本发明进一步对离心转数和离心时间进行优化，离心的转数分别为3000、3500、4000、4500rpm，离心时间分别为3、5、8、10min。结果表明，离心转数4000rpm、不同离心时间条件下，1-6号菌的T-2毒素的提取量均高于其他转数；其中，采用离心转数为4000rpm，离心时间为5min，6种不同的镰刀菌T-2毒素的提取量最高，与离心转数4000rpm，时间3min条件下相比，1-6号菌的T-2毒素提取量分别提高了2％-9.8％；继续延长离心时间，1-6号菌的T-2毒素提取量开始下降。因此，本发明选择离心转数4000rpm，离心时间为5min。