[发明专利]用于鉴定嗜群血蜱的靶序列、引物、鉴定方法及试剂盒

说明书

本发明提供了用于鉴定嗜群血蜱的靶序列、引物、鉴定方法及试剂盒，属于蜱虫检测与鉴定技术领域。所述靶序列为用于鉴定嗜群血蜱的特异性DNA序列，如SEQ ID NO.1所示，是本发明扩增出的嗜群血蜱COI序列的一段。通过序列分析，确定保守区域设计了可特异性扩增嗜群血蜱COI部分序列的引物对，序列如SEQ ID No.2和3所示。本发明克服了传统嗜群血蜱分类鉴定对标本完成性要求高、对鉴定者的专业分类水平要求高等诸多问题，提供的PCR引物及鉴定方法以及试剂盒操作方便，灵敏度高、特异性强、简单快速、成本低，能够满足嗜群血蜱快速、准确的物种分子鉴定需求，具有良好的应用前景。

技术领域

本发明涉及蜱虫检测与鉴定技术领域，具体地涉及用于鉴定嗜群血蜱(Haemaphysalis concinna)的靶序列、特异性引物对、鉴定方法及试剂盒。

背景技术

嗜群血蜱(Haemaphysalis concinna)属硬蜱科，血蜱属，广泛分布于我国北方草原地区(包括黑龙江、吉林、辽宁、内蒙、甘肃、宁夏和新疆等)。另外，嗜群血蜱还分布于国外蒙古国、日本、朝鲜、伊朗、土耳其以及捷克、罗马尼亚、德国等广大地区。其成蜱主要寄生于大型哺乳类动物(包括有蹄类和食肉类)，也侵袭人。幼蜱和若蜱寄生于小型哺乳类动物及鸟类。嗜群血蜱作为媒介可传播森林脑炎、Q热、北亚蜱媒斑点热等疫病。

目前，嗜群血蜱的物种鉴定主要依靠形态学特征，该鉴定方法对鉴定者的专业知识和蜱虫样本完整性均要求较高，又由于蜱虫易与形态近似种混淆，造成嗜群血蜱的鉴定结果费时、费力且准确度和重复性都不高。近年来，分子生物学技术已经被广泛应用于物种鉴定，目前在嗜群血蜱的鉴定方面报道较少，Genbank数据库中有嗜群血蜱的COI序列，但是其与Genbank数据库中的已认证的另外一个参考序列(NCBI reference sequence)Haemaphysalis parva(NC020335.1)一致，而该序列明确说明是属于Haemaphysalisparva，因此申请人认为目前Genbank数据库中公开的COI序列并非是嗜群血蜱(Haemaphysalis concinna)的。

发明内容

本发明的第一个目的在于克服现有检测技术的不足，提供一种用于鉴定嗜群血蜱的特异性靶序列。

本发明的第二个目的在于提供用于扩增特异性靶序列的引物对。

本发明的第三个目的在于提供鉴定嗜群血蜱的方法及试剂盒。

为实现上述目的，本发明首先利用发明人设计的蜱虫COI全长序列扩增引物对嗜群血蜱的COI序列进行扩增。

COI-CF：5’-ATTTTACCGCGATGAATATTYTC-3’(SEQ ID NO.4)

COI-CR：5’-TTATTTTAAAATAATRTT-3’(SEQ ID NO.5)。

上述序列中，Y和R分别为兼并引物，Y＝C/T，R＝A/G。

COI-CF与COI-CR扩增出嗜群血蜱的COI全长序列，长1539bp，其电泳图如图1所示。

本发明根据扩增引物COI-CF和COI-CR扩增的嗜群血蜱的COI全长序列，通过MEGA软件中CLUSTALW程序，将该序列与Genbank数据库以及发明人扩增的同属其他血蜱COI序列进行比对分析，筛选出嗜群血蜱特异性序列并设计扩增引物，共设计正向引物2条，反向引物2条。它们分别为：

正向引物HC-F：5'CTCTTCTTTAGTAGAAAGTGGTGT3'(如SEQ ID NO.2所示)

反向引物HC-R：5'GGTCAAAAAATGAAGTATTGAAG3'(如SEQ ID NO.3所示)。

正向引物HC-F1：5’-ATATCCGCCCCTTTCT-3’(如SEQ ID NO.6所示)