[发明专利]培养铁皮石斛原球茎的方法

权利要求书

1.一种培养铁皮石斛原球茎的方法，包括如下步骤 ：

（1）前期准备：

①固体培养基配制：固体培养基的配方为 1/2MS 基本培养基，添加 NAA 0.1~5.0 mg/L；蔗糖浓度 20~50 g/L；香蕉液 30~80 g/L；琼脂粉 4~10 g/L，调整 pH 值 5.0~7.0，煮沸，分装，灭菌处理后，备用；

②液体增殖培养基配制：液体增殖培养基的配方为 1/2MS 基本培养基，添加 NAA0.1~5.0 mg/L；6-BA 0.1~10.0 mg/L；蔗糖浓度30~50 g/L；香蕉液 40~80 g/L，调整 pH 值5.0~7.0，培养液配制完成后，煮沸，分装，灭菌处理后，备用；

③生物反应器灭菌：将生物反应器进行组装，在组装过程中将玻璃珠放入生物反应器中，然后包扎灭菌；灭菌处理后，备用；

（2）原球茎的萌发与增殖培养：

将外植体接种于 1/2 MS 固体培养基中，进行原球茎的萌发与增殖，然后经过 3~5 次继代培养，筛选出生长快、增殖率高、无明显分化的铁皮石斛原球茎，作为生物反应器生产铁皮石斛原球茎的种子；

（3）过渡观察培养：

将步骤（2）中筛选出的优质原球茎先接种到液体增殖培养基中进行观察培养，接种密度 10~70 g/L，培养时间 3~5d；

（4）生物反应器培养：

将步骤（3）中的原球茎接种到间歇浸没生物反应器中，接种密度 10~70 g/L；浸没频率5~30 min/4~12 h，培养时间 20~60 d；培养条件：光照强度 1000~3000 lux，光照 12 h/d，温度 10~30℃；

所述步骤（4）生物反应器培养中，所述生物反应器的生长盘内平铺一层玻璃珠，所述玻璃珠的直径为 1~10mm。

2.根据权利要求 1 所述的培养铁皮石斛原球茎的方法，其特征在于，所述步骤（1）前期准备中，所述固体培养基，添加 NAA 0.2~0.8 mg/L，蔗糖浓度 20~40 g/L，香蕉液 40~60g/L，琼脂粉 4~8g/L，调整 pH 值 5.8~6.2；所述液体增殖培养基，添加 NAA 0.1~0.8 mg/L，6-BA2.0~8.0 mg/L，蔗糖浓度 30~40 g/L，香蕉液 40~60 g/L，调整 pH 值 5.8~6.2。

3.根据权利要求 2 所述的培养铁皮石斛原球茎的方法，其特征在于，所述步骤（1）前期准备中，所述香蕉液为香蕉匀浆或香蕉提取液。

4.根据权利要求 3所述的培养铁皮石斛原球茎的方法，其特征在于，所述步骤（2）原球茎的萌发与增殖培养中，所述外植体为铁皮石斛无菌种子或无菌苗茎段横截面组织薄片。

5.根据权利要求3 所述的培养铁皮石斛原球茎的方法，其特征在于，所述步骤（4）生物反应器培养中，接种密度 10~70 g/L；浸没频率 5~20 min/4~8 h；培养时间 20~60 d。

6.根据权利要求4 所述的培养铁皮石斛原球茎的方法，其特征在于，所述铁皮石斛无菌种子的灭菌方法包括清洗和消毒。

7.根据权利要求6所述的培养铁皮石斛原球茎的方法，其特征在于，所述清洗的方法包括以下步骤：选择饱满铁皮石斛果荚；在无菌环境中，用 60~80% 的无水乙醇浸泡种子 15~30 s，无菌水清洗 1~4 次后；再用 0.05~0.15% 的氯化汞浸泡 10~20min，无菌水清洗 3~7 次。