[发明专利]利用间歇浸没生物反应器培育白芨种苗的方法

权利要求书

1.一种利用间歇浸没生物反应器培育白芨种苗的方法，依次包括种子杀菌步骤，种子萌发步骤，增殖培养步骤，假鳞茎生成培养步骤和假鳞茎膨大培养步骤，其特征在于，利用间歇浸没生物反应器快速培养白芨种苗的方法是在无菌条件下进行的，所述增殖培养步骤包括过渡增殖培养步骤和增殖及生根培养步骤；所述种子杀菌步骤前还需要一个前期准备步骤，

所述前期准备步骤包括：①挑选种荚：挑选饱满的良种；②反应器和透明器皿灭菌：将反应器和透明器皿包扎，高温高压湿热灭菌后备用；③配制培养基和培养液；

所述种子杀菌步骤是在无菌条件下，对白芨种荚进行表面杀菌，获得无菌种子；

所述种子萌发是将无菌种子均匀撒落在固体培养基中进行种子萌发培养；

所述过渡增殖培养是在无菌条件下，将萌发后的白芨幼苗转接到透明器皿中，在恒温下使用过渡增殖培养基通过摇瓶方式进行过渡增殖培养；

所述增殖及生根培养是在无菌条件下，将透明器皿中的白芨过渡增殖苗转接到无菌的间歇浸没生物反应器中，在恒温下使用增殖及生根培养液进行增殖及生根培养；

所述假鳞茎生成培养是增殖及生根培养结束后，在同一间歇浸没生物反应器中，更换培养液，即将增殖及生根培养液更换为微型假鳞茎生成培养液，在恒温下进行培养获得带有微型假鳞茎白芨种苗；

所述假鳞茎膨大培养是假鳞茎形成后，在同一间歇浸没生物反应器中，更换培养液，即将微型假鳞茎生成培养液替换为促进假鳞茎膨大的培养液，在恒温下进行假鳞茎膨大培养，获得带有膨大假鳞茎白芨种苗；

所述种子杀菌步骤包括如下步骤：

①表面去污：采用自来水水流冲洗白芨种荚，冲洗时间为30～60min，清洗掉种荚表面的脏污；

②表面消毒：在无菌条件下，将其放于70～75％的酒精中，浸泡时间为10～60s，无菌水冲洗2～3次；

③表面杀菌：放入浓度为0.1～0.3％氯化汞中浸泡时间为1～20min，无菌水冲洗5～7次；得到无菌白芨种荚；

所述种子萌发步骤中，所述固体培养基的配方为：采用1/2MS液体为基本培养液，添加激素NAA 0.5～2.0mg/L，土豆泥10～50g/L，蔗糖浓度10～50g/L，琼脂浓度1.0～7.0g/L，调整pH值5.0～7.0；设定的培养条件为：黑暗培养5～30d，然后转入光照条件下培养，培养时间为10～90d，光照强度1500～2000lx，光照时间1～18h/d，温度为24±1℃；

所述过渡增殖培养步骤中，所述透明器皿采用的材料为玻璃或塑料，所述透明器皿为三角烧瓶或集气瓶，所选取的容量为100～500ml；培养时间为7～20d；所采用的过渡增殖培养基为液体或半固体，过渡增殖培养基的配方为：采用1/2MS液体为基本培养液，添加激素NAA 0.5～2.0mg/L，土豆液10～60g/L，蔗糖10～50g/L，琼脂0～5g/L，调整pH值5.0～7.0；设定的培养条件为：将所述透明器皿置于摇床上，设置转速为60～120rpm，光照强度1500～2000lx，光照时间1～18h/d，温度24±1℃；

所述增殖及生根培养步骤中，所述间歇浸没生物反应器的反应条件为：间歇浸没频率1～10min/4h，接种密度10～50g/L，培养时间30～90d；所述增殖及生根培养液的配方为：采用1/2MS液体为基本培养液，添加激素NAA 0.5～2.0mg/L，土豆液20～90g/L，蔗糖10～50g/L，调整pH值5.0～7.0；设定的培养条件为光照强度1500～2000lx，光照时间1～18h/d，温度24±1℃；

所述假鳞茎生成培养步骤中，所述微型假鳞茎生成培养液的配方为：采用1/2MS液体为基本培养液，添加激素NAA 0.5～2.0mg/L，土豆液20～90g/L，香蕉汁10～90g/L，蔗糖10～50g/L，调整pH值5.0～7.0；设定的培养条件为光照强度1500～2000lx，光照时间1～18h/d，温度24±1℃；所述间歇浸没生物反应器的间歇浸没频率设置为1～10min/4h，培养时间10～30d；

所述假鳞茎膨大培养步骤中，所述促进假鳞茎膨大的培养液的配方为：采用MS液体为基本培养液，添加激素NAA 0.5～2.0mg/L，土豆液20～90g/L，香蕉汁10～80g/L，秸秆汁20～120g/L，蔗糖10～50g/L，调整pH值5.0～7.0；设定的培养条件为光照强度1500～2000lx，光照时间8～18h/d，温度24±1℃；所述间歇浸没生物反应器的间歇浸没频率设置为1～10min/6h，培养时间20～90天。

2.根据权利要求1所述的利用间歇浸没生物反应器培育白芨种苗的方法，其特征在于，

所述种子杀菌步骤中，所述步骤①表面去污中冲洗时间为30～40min；所述步骤②表面消毒中，所述浸泡时间为30s；所述步骤③表面杀菌中，所述浸泡时间为5～20min；

所述种子萌发步骤中，所述固体培养基的配方为：采用1/2MS液体为基本培养液，添加激素NAA 0.5～1.0mg/L，土豆泥20～30g/L，蔗糖浓度30～40g/L，琼脂浓度5.0～6.5g/L，调整pH值5.8～6.0；设定的培养条件为：黑暗培养7～15d，然后转入光照条件下培养，培养时间为30～50d，光照时间10～12h/d；

所述过渡增殖培养步骤中，所述培养时间为10～15d；所述培养基的配方为：采用1/2MS液体为基本培养液，添加激素NAA 0.5～1.0mg/L，土豆液50g/L，蔗糖30～40g/L，琼脂0～3g/L，调整pH值pH5.8～6.0；摇床的转速为60～90rpm，光照时间10～12h/ d，培养时间为10～15d；

所述增殖及生根培养步骤中，所述间歇浸没频率1～3min/4h，接种密度20～30g/L；培养时间40～60d；所述增殖及生根培养液的配方为：采用1/2MS液体为基本培养液，添加激素NAA 0.5～1.0mg/L，土豆液30～50g/L，蔗糖30g～40/L，调整pH值5.8～6.0，光照时间10～12h/d；

所述假鳞茎生成培养步骤中，所述微型假鳞茎生成培养液的配方为：采用1/2MS液体为基本培养液，添加激素NAA 0.5～1.0mg/L，土豆液30～50g/L，香蕉汁30～60g/L，蔗糖30g～40/L，调整pH值5.8～6.0，光照时间10～12h/d；所述间歇浸没频率设置为1～3min/4h；

所述假鳞茎膨大培养步骤中，所述促进假鳞茎膨大的培养液的配方为：采用MS液体为基本培养液，添加激素NAA 0.5～1.0mg/L，土豆液30～50g/L，香蕉汁30～50g/L，秸秆汁30～60g/L，蔗糖30～50g/L，调整pH值5.8～6.0；设定的培养条件为光照强度1500～2000lx，光照时间12～14h/d；所述间歇浸没生物反应器的间歇浸没频率设置为1～3min/6h，培养时间为30～60d。