[发明专利]用于牛新孢子虫病防控的疫苗及其制备方法和应用

说明书

本发明提供用于牛新孢子虫病防控的疫苗及其制备方法和应用。该疫苗为基因佐剂重组腺病毒载体疫苗，编码该疫苗抗原的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。该疫苗的制备方法具体为根据犬新孢子虫NcSRS9基因序列和IFN‑γ基因序列的开放阅读框设计引物，扩增拼接NcSRS9基因和IFN‑γ基因，构建pMD18T‑NcSRS9‑IFN‑γ重组克隆质粒，构建重组腺病毒穿梭质粒pCR259‑NcSRS9‑IFN‑γ和表达质粒H294‑NcSRS9‑IFN‑γ，脂质体介导转染QBI‑HEK 293细胞包装Ad5‑NcSRS9‑IFN‑γ重组腺病毒，扩增、纯化制备重组腺病毒载体疫苗。

技术领域

本发明涉及寄生虫病疫苗基因工程技术领域，提供一种用于牛新孢子虫病防控的基因佐剂重组腺病毒载体疫苗及其制备方法和应用。

背景技术

新孢子虫病(Neosporiasis)是由犬新孢子虫(Neospora caninum)寄生于犬、牛、羊等多种哺乳动物细胞内而引起的一种原虫病，该病主要引起母畜流产、死胎或新生儿运动障碍和神经系统疾病。1988年，Dubey等人首次从一只下肢瘫痪的犬体内分离到该虫体，并且将其命名为犬新孢子虫。犬新孢子虫的终末宿主是犬，多种哺乳动物都可以作为中间宿主，它的寄生部位是中枢神经系统、脑、肝、肌肉及其它内脏组织。犬新孢子虫对牛的危害最为严重，可垂直传播，带虫母牛可将虫体直接传给新生犊牛，已成为严重威胁养牛业健康发展的重要繁殖障碍性疾病。

国外对犬新孢子虫的研究已取得了一定进展，而国内对犬新孢子虫的研究尚属起步阶段。目前对犬新孢子虫疫苗的研究大多采用传统的方法，如利用犬新孢子虫表面抗原蛋白基因制备重组蛋白亚单位疫苗，或利用真核表达载体制备核酸疫苗等，而制备亚单位疫苗或核酸疫苗均存在免疫效果不佳，保护率低下等问题，尚不能用于新孢子虫病的防控。并且，国内外尚无牛源犬新孢子虫相关疫苗的问世，也未见基因佐剂重组腺病毒载体疫苗的相关报道。

发明内容

本发明是鉴于现有技术中存在的上述问题而做出的，其目的是提供一种用于牛新孢子虫病防控的疫苗，该疫苗为基因佐剂重组腺病毒载体疫苗，可用于对牛新孢子虫病进行防控。

本发明的另一目的是提供一种上述疫苗的制备方法。

本发明的再一目的是提供抗原的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1在制备用于牛新孢子虫病防控的疫苗中的用途。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种用于牛新孢子虫病防控的疫苗，该疫苗为基因佐剂重组腺病毒载体疫苗，编码该疫苗抗原的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

进一步地，所述基因佐剂为IFN-γ基因。

进一步地，所述重组腺病毒载体为pCR259、HighQ-1Transpose-Ad^TM294和HighQ-1^TM。

一种制备用于牛新孢子虫病防控的疫苗的方法，包括：

a.引物设计，根据犬新孢子虫NcSRS9基因序列(EF440644.1)和IFN-γ基因序列(M29867.1)的开放阅读框，设计引物P1、P2、P3和P4，所述引物P1、P2、P3和P4分别为：

P1：5’-CGGGATCCGCCACCATGGCGAGGAGAGGAAGCA-3’

P2：

5’-ACCAGAACCTCCACCTCCAGATCCACCTCCACCCAAAAGGGAACTAGCGAAGAGG-3’

P3：

5’-GGATCTGGAGGTGGAGGTTCTGGTGGTGGAGGATCTGCTTTACTGCTCTGTGGGCTT-3’