[发明专利]弗氏柠檬酸杆菌荧光定量PCR诊断试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种试剂盒，尤其是一种弗氏柠檬酸杆菌荧光定量PCR诊断试剂盒。

背景技术

弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)是革兰氏阴性短杆菌，在土壤、水体、污水、食物中广泛存在，为人和动物肠道的正常菌群，该菌是一种条件致病菌，可引起人、畜、鱼类的败血症^[1-3]。近几年，贵州省冷水鱼的养殖发展迅速，主要品种有虹鳟、金鳟、斑点鳟鲑、鲟鱼、以及大鲵。随着冷水鱼养殖场（户）集约化程度不断提高，苗种流通交换量不断加大，病害逐渐增多，病情不断愈趋复杂。目前报道的病害报道主要集中在鲟鱼、虾、中华鳖，鳟鲑鱼、大鲵报道较少，感染该菌的鲟鱼、虾、中华鳖、鳟鲑鱼和大鲵出现消化不良或拒食，头部、腹部肿大，轻度腹水，皮下有出血点等症状，随后死亡^[4-7]。

发明内容

本发明的目的是：传统的细菌分离鉴定耗时较长，不能快速、准确地得到鉴定结果，从而对症下药。应用荧光定量PCR技术进行疾病病原菌的鉴定和诊断，较普通PCR反应程序快、特异性强、灵敏度高、重复性好、结果简单可视。提供一种弗氏柠檬酸杆菌荧光定量PCR诊断试剂盒，它可以快速检测弗氏柠檬酸杆菌，并且简便、灵敏、准确、特异性强。

本发明是这样实现的：弗氏柠檬酸杆菌荧光定量PCR诊断试剂盒，它包括250μL荧光定量PCR反应混合液；上游引物20μL、浓度为10nmol/μL、下游引物20μL、浓度为10nmol/μL；荧光核酸染料25μL、浓度为25mmol/μL；40μL阳性对照；40μL阴性对照；170μL超纯水；上游引物的序列为：5'-CTTGCTCCTTGGGTGACGAGTGG-3'，下游引物的序列为： 5'-TCTTTGGTCTTGCGACGTTATGC-3'。

阴性对照为超纯水。

阳性对照为标准弗氏柠檬酸杆菌16S rRNA基因pMD-18T阳性质粒样品。

荧光定量PCR反应混合液由5 mmol/μL的氯化镁，1000pmol/μL的 dNTP 4.0μL，25mmol/μL的Tris-HCl及0.2μL Taq酶组成。

试剂盒的保存期检测

试剂盒保存期：将试剂盒各组份于室温、4 ℃、-20 ℃，保存时间1周、3月、6月、1年，对标准阳性样品进行检测。4℃保存1年阳性拷贝数降低100倍，-20℃保存1月、3月、6月、1年对阳性拷贝数无影响。

本发明根据GenBank中弗氏柠檬酸杆菌16S rRNA基因序列，设计1对特异性的引物，通过PCR扩增获得弗氏柠檬酸杆菌16S rRNA基因片段，T克隆到pMD-18T载体上作为标准阳性样品。通过优化SYBR Green I荧光定量PCR反应条件，建立了弗氏柠檬酸杆菌SYBR Green I荧光定量PCR诊断方法，再以建立的诊断方法研制出试剂盒。试剂盒对致病性嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌、黄杆菌、迟缓爱德华菌均无阳性信号扩增，重复性好，扩增产物的熔解曲线只出现1个特异性峰值，无引物二聚体，灵敏度可达1.0×10^１拷贝/μL，结果表明，研制的弗氏柠檬酸杆菌SYBR Green I荧光定量PCR试剂盒适合于弗氏柠檬酸杆菌临床疑似病料样品的快速诊断。

为了验证本发明的技术效果，进行了以下实验：

弗氏柠檬酸杆菌荧光定量PCR诊断方法的建立

1  材料与方法

1.1  试验材料

菌株：弗氏柠檬酸杆菌、致病性嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌、黄杆菌、迟缓爱德华菌，由贵州重大疫病监测防制重点实验室保存。

主要试剂：MIX PCR酶、pMD-18T、SYBR Green I荧光定量PCR酶、Goldview、1×TAE电泳缓冲液、DL2000、DH5α，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，细菌基因组DNA提取试剂盒、PBS缓冲液等购自上海捷瑞生物工程公司，引物为上海捷瑞生物工程公司合成，其他为国产试剂。

主要仪器：EppendorfMastercycler ep realplex 4 实时荧光定量PCR仪。

试验方法

1.2.1  引物设计