[发明专利]一种高拷贝基因串联体的快速构建方法

说明书

本发明一种高拷贝基因串联体的快速构建方法，涉及分子生物学领域。具体涉及多聚化法构建串联多拷贝。该方法为一锅法反应，不需要对载体进行去磷酸化和纯化回收，操作步骤少而且简单，获得的基因拷贝数高，8拷贝以上的串联基因占了总数的66%（对照例为10%），同时利用该步骤获得的基因同样可以进一步采用递归定向连接法获得更高拷贝的基因。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，更具体地，涉及一种高拷贝基因串联体的快速构建方法。

背景技术

生物活性肽是天然氨基酸以不同组成和排列方式构成的从二肽到复杂的线性、环形结构的具有生物活性的不同肽类的总称。活性肽具有调节人体生理和代谢功能，易消化吸收，有促进免疫、激素调节、抗菌、抗病毒、降血压和降血脂等多种作用，具有较高的食用安全性，是当前国际食品界最热门的研究课题和极具发展前景的功能因子之一。

目前，制备生物活性肽的方法主要集中在利用蛋白酶酶解法和发酵法，但均存在着天然原料活性肽含量低、水解产物成分复杂、分离纯化环节多、产率低和产品成本高等问题。化学合成法具有成本高、副反应物多及残留化合物等缺点。利用基因工程技术的发展为制备重组蛋白提供新的方法，但用于生产小分子肽的困难主要在于：(1)产物不稳定，多肽分子量小，易被宿主蛋白酶识别，易被降解；(2)产物有毒性，制约宿主菌生长和小肽的表达。

小分子多肽与宿主标签蛋白融合表达有利于提高多肽稳定性，降低产物毒性和提高表达量，其缺陷在于目的肽在融合蛋白中所占比例小，造成宿主表达潜能浪费，而减小标签蛋白长度，又降低融合蛋白稳定性。将多肽基因串联表达可有效解决以上问题：(1)串联增加了多肽基因数量，有利于提高表达量；(2)串联多聚体形式的表达可有效屏蔽宿主毒性；(3)多聚体表达产物更稳定。

因此快速准确地构建小肽的串联基因就显得非常必要。目前的方法主要集中在多聚化法（Multimerization）和递归定向连接法（Recursive directional ligation）。多聚化法是指基因片段根据非回文粘性末端定向自连后，再与载体相连，即可以通过一次构建获得含有多种拷贝数基因的库。递归定向连接法是利用同尾酶酶切位点的特点，通过一次构建循环使载体上的基因拷贝数增加一倍，此方法可以得到准确得到需要拷贝数的基因，但是要得到较高拷贝数需要较多的循环次数，耗时长。相比递归定向连接法，多聚化法构建速度快，但缺点在于构建的基因库中基因的拷贝数是随机的，不能保证能得到某一特定拷贝数的基因。McDaniel等研究者设计了一种新的思路，将两种方法结合使用，即先用多聚化法得到一些低拷贝的基因，在此基础上构建高拷贝的基因，该方法可以大大缩短构建周期。但是在其中多聚化方法的流程中，操作步骤多，包括载体酶解、载体去磷酸化、载体纯化回收、目的基因片段自连和自连产物与载体相连等步骤，同时构建的基因库中存在着基因拷贝数偏低的问题，而这些问题还缺乏有效的解决方法。

发明内容

本发明的目的是为了克服已有技术存在的问题，提供一种新型多聚化法，可以更加简单有效构建多拷贝串联基因。

为了实现上述发明目的，其具体的技术方案如下：

1、改造载体

在克隆载体多克隆位点或者其他区域插入一段含有3个classⅡS（G）限制性内切酶位点的双链寡核苷酸链。

其中3个内切酶在双链寡核苷酸链上共用一段酶切位点，两个内切酶A和B的酶切位点在识别序列的一侧，如AarⅠ、BbsⅠ和BveⅠ等，这两个内切酶反向共用一段酶切位点，内切酶C识别位点在一段序列的两侧，切割位点在这段序列中间，如AasⅠ、AdeⅠ和BglⅠ。这3个内切酶在改造后的载体上酶切位点是唯一的。

2、获得目的基因