[发明专利]鲍曼不动杆菌携带qacE*1-sull基因的检测方法

权利要求书

1.一种利用高分辨熔解曲线分析技术检测鲍曼不动杆菌中耐消毒剂qacE?1-sull基因携带情况的方法其特征在于，具体步骤为：

第一步：从临床分离环境标本中的鲍曼不动杆菌株，高温灭活，提取样本DNA，作为检测样品；取不携带qacE?1-sull基因的铜绿假单胞菌菌株，高温灭活，提取样本DNA，作为阴性对照品；人工合成qacE?1-sull序列，构建携带qacE?1-sull基因的重组质粒为阳性对照品；全部菌株均使用法国梅里埃公司VITEK32全自动微生物分析仪鉴定菌种;

第二步：用无菌水配制浓度为5-15umol/L的qacE?1-sull基因正向引物溶液以及浓度为5-15umol/L的qacE?1-sull基因反向引物溶液；qacE?1-sull基因正向引物的序列为：5′- tcggtgttgcttatgcagtc-3′，qacE?1-sull基因反向引物的序列为：5′- gcaattatgagccccatacc-3′；

第三步：在每一个PCR反应孔中依次加入Type-it HRM PCR Mix 7.5ul和第二步所得的qacE?1-sull基因正向引物溶液0.5ul、qacE?1-sull基因反向引物溶液0.5ul，然后在不同的PCR反应孔中分别加入第一步得到的检测样品、阴性对照品及阳性对照品各2ul，用灭菌重蒸馏水补足15ul；在Rotor-Gene Q上进行反应，PCR反应条件为92-97℃变性5-15分钟，92-97℃变性10-30秒，57-65℃退火10-30秒，70-75℃延伸10-30秒，30-50个循环；HRM反应条件：92-97℃变性1分钟，40℃复性1分钟，初始熔解温度60-65℃开始程序升温熔解至95℃，过程中实时监测荧光信号，30-50次每秒;

第四步：应用Rotor-Gene Q软件分析HRM结果，有扩增曲线的即为携带qacE?1-sull基因。