[发明专利]基于结合抑制点击化学反应检测小分子配体靶蛋白的荧光生物传感方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测小分子配体靶蛋白的荧光生物传感方法，特别涉及一种基于结合抑制点击化学反应检测小分子配体靶蛋白的荧光生物传感方法。

发明背景

蛋白质作为生命有机体的基本组成部分和细胞功能的重要执行者，几乎参与了所有的生理和病理过程，而这些过程又往往涉及到蛋白质和小分子配体之间的相互作用。因此蛋白质-小分子配体相互作用的相关研究，特别是以此为基础的小分子配体靶蛋白的分析检测具有十分重要的意义。它不仅有助于揭示蛋白质和小分子配体参与的复杂细胞通路机制，而且可以为临床诊断、新药开发设计等提供必要的数据信息支持。传统的小分子配体靶蛋白的检测技术主要包括毛细管电泳、蛋白质片断互补测定、表面等离子共振和荧光各向异性分析等。这些方法虽各有优势，但同时也存在操作繁琐、仪器设备昂贵、灵敏度不足等缺陷。

近年来，通过共价键合的方式将小分子与寡核苷酸DNA链相耦连发展出了一类新型的小分子配体功能化的核酸探针，其既具备小分子配体高亲和力和高特异性的靶蛋白结合能力，又具有DNA分子良好的设计灵活型。利用这类新型核酸探针，若干种简便快捷且灵敏度高的小分子配体靶蛋白检测新方法得以建立，进一步促进了相关领域的发展。但与此同时，这些新方法往往依赖于核酸工具酶参与的末端保护机制，而工具酶的活性在血清等复杂样本中易受酸度、离子浓度和其他分子的影响或污染，这将严重阻碍相应方法在复杂样本中的实际应用。在此背景下，发明一种无需工具酶参与的简单、灵敏的小分子配体靶蛋白检测新方法显得尤为重要。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，针对现有方法的不足，提出一种无需工具酶参与的具有较高选择性和灵敏度的检测小分子配体靶蛋白的荧光生物传感方法。该方法依赖于寡核苷酸DNA链末端修饰的特定小分子配体与其靶蛋白的特异性分子识别以及结合抑制的点击化学反应，并借助由铜纳米颗粒和石墨烯组成的荧光淬灭纳米探针体系，实现对于目标蛋白的荧光定量检测。

为实现上述目的，本发明采用如下机理：设计两条碱基完全互补的DNA单链P1和P2，其中P1的5'末端含有叠氮基团，P2的3'末端修饰有特定小分子配体；在室温条件下，P1和P2在溶液中杂交形成双链，成为具有荧光发射特性的铜纳米颗粒合成的模板。另外设计一条3'末端进行炔基功能化的DNA单链P3，其可以在亚铜离子（Cu⁺）存在的条件下通过末端炔基与叠氮基团间的偶极环加成“点击化学”反应实现与P1链的连接，形成具有单链分支的P1-P2-P3复合DNA结构；此时，若向检测体系中引入氧化石墨烯，上述DNA复合结构由于单链分支与氧化石墨烯之间的相互作用而被稳定吸附到氧化石墨烯表面，最终导致以P1-P2双链为模板合成的铜纳米颗粒的荧光被显著淬灭。另一方面，当检测体系中存在小分子配体靶蛋白时，靶蛋白可以通过与小分子配体间的高亲和力和特异性的分子识别过程而连接到P2链末端，形成蛋白结合的P1-P2双链。这种情况下，由于蛋白结合所形成的巨大位阻效应，P1和P3链末端的叠氮和炔基基团无法彼此靠近，从而抑制了点击化学反应的发生；此时，若向检测体系中引入氧化石墨烯，只有游离的P3单链被吸附至氧化石墨烯表面，而P1-P2双链远离氧化石墨烯，从而使以其为模板形成的铜纳米颗粒的荧光得以较好地保持。基于以上过程，我们就可以通过分析最终反应体系中铜纳米颗粒的荧光强度，实现对小分子配体靶蛋白的定量检测。

根据上述机理，本发明采用的技术方案：

一种基于结合抑制点击化学反应检测小分子配体靶蛋白的荧光生物传感方法，其特征在于该方法的具体步骤为：

（a）设计并合成三条末端分别修饰叠氮基团、小分子配体和炔基基团的寡核苷酸DNA单链；其中，修饰有叠氮基团的寡核苷酸DNA单链 P1的序列为：5'-Azide-GAAGTCATGAGCGTATGAGTA-3'，修饰有小分子配体的寡核苷酸DNA单链P2的序列为：5'-TACTCATACGCTCATGACTTC-小分子配体-3'，修饰有炔基基团的寡核苷酸DNA单链P3的序列为：5'-CGATCCAGGTCATGC-Alkyne-3'；

（b）单链P1和单链P2互补杂交形成DNA双链，且杂交形成双链后叠氮基团和小分子配体位于双链的同一侧末端；具体步骤为：将单链P1和单链P2按1:1的摩尔比混合于MOPS缓冲溶液中，搅拌均匀后在20~30 ºC条件反应2~3小时，以使P1和P2链互补杂交形成双链；