[发明专利]一种表达非洲猪瘟病毒p72蛋白的重组病毒疫苗株

说明书

本发明提供一种表达非洲猪瘟病毒p72蛋白的重组新城疫病毒疫苗株的制备方法及重组新城疫病毒疫苗株。本发明的方法包括：构建其中插入非洲猪瘟病毒（ASFV）的p72基因的重组转录质粒，构建转录辅助质粒系统，将上述转录质粒和转录辅助质粒共转染所述新城疫致弱株可以复制的宿主细胞BHK‑21，拯救获得重组病毒株。利用本发明制备的表达非洲猪瘟病毒p72蛋白的疫苗株，在防控该动物疫病方面具有重要的储备和战略意义，并可在治疗与预防非洲猪瘟病毒中应用。

技术领域

本发明提供一种表达非洲猪瘟病毒p72蛋白的重组新城疫病毒疫苗株的制备方法及重组新城疫病毒疫苗株。

背景技术

非洲猪瘟（African Swine Fever，ASF）是由非洲猪瘟病毒科的唯一成员非洲猪瘟病毒（ASFV）引起的一种急性、发热、传染性很高的疾病 [1]。家猪和欧洲野猪普遍易感，呈现复杂的临床症状，引起消化系统和呼吸系统充血、出血以及功能紊乱，在家猪中是一种高度接触性传播疫病 [2-4]。非洲野猪通常呈现亚临床和没有临床症状的感染，为该病的贮藏宿主；软蜱中钝缘蜱属的成员（Ornithodoros erraticus、Ornithodoros moubata）可以作为该病的生物学媒介和病毒的贮藏宿主 [5, 6]。该病发病过程短，潜伏期5-15天，有很高的发病率和死亡率，死亡率甚至可高达100% [7, 8]。

早在1921年，非洲猪瘟在肯尼亚首次报道，引起家猪100%的死亡 [9]。此后，该病一直在非洲流行，直到1957年，由于给猪饲喂航班上的垃圾和剩余食物引起该病在葡萄牙的暴发 [10]。随后在欧洲的其他一些国家蔓延，包括马耳他 (1978), 意大利 (1967,1980), 法国 (1964, 1967, 1977), 比利时(1985) 荷兰（1986），之后，除了撒丁岛，该病在这些国家相继消灭 [5]。从2005年到2010年，全世界共有25个国家报道有非洲猪瘟的暴发，主要包括非洲国家以及意大利、俄罗斯等欧洲国家 [11]。2007年，该病由于国际船只运输感染的猪肉而传入高加索地区的格鲁吉亚，并且迅速蔓延到相邻的国家，包括亚美尼亚、阿塞拜疆和俄罗斯 [12]。目前，我国尚无该病的报道，我国与俄罗斯存在4300多公里的边境线，同时由于世界贸易的关系，特别是中非之间贸易以及联系的进一步加强，加剧了我国所面临非洲猪瘟传入风险增加的局面。目前，非洲猪瘟尚无有效的疫苗可以预防该病，防控该病主要依靠快速诊断和扑杀。国外对于非洲猪瘟疫苗的研究已经有不少的报道，但是传统的灭活疫苗不能对非洲猪瘟病毒感染产生有效的免疫保护。1960年，非洲猪瘟在葡萄牙暴发期间，利用传代弱化的毒株进行免疫预防，部分免疫的猪发病甚至死亡，另外，由于免疫接种导致出现大量的带毒猪，对后期该病的扑灭非常不利，而且接种传代弱化的非洲猪瘟弱毒疫苗存在病毒毒力返强的风险。

发明内容

本发明提供一种表达非洲猪瘟病毒p72蛋白的重组新城疫病毒MG7疫苗株的方法及其疫苗株。

本发明的表达非洲猪瘟病毒p72蛋白的重组病毒疫苗株的制备方法包括：

（1）构建重组转录质粒，该重组转录质粒包括其中插入非洲猪瘟病毒（ASFV）的p72基因的新城疫弱毒疫苗株MG7的基因组cDNA序列，然后在转录载体质粒pBSK中连接组装获得重组转录质粒pBSK-MG7-ASFVp72。其中，新城疫弱毒疫苗株MG7是通过反向遗传学改造，将其F蛋白裂解位点替换为Lasota株F蛋白的裂解位点，由此突变致弱的的人工致弱毒株；

（2）构建转录辅助质粒系统，该辅助质粒系统包括：编码所述新城疫病毒致弱株的核蛋白（NP）的cDNA序列的辅助质粒pBSK-NP和所述新城疫病毒致弱株的磷蛋白（P）的cDNA序列的辅助质粒pBSK-P以及所述新城疫病毒致弱株的大聚合酶蛋白（L）的cDNA序列的辅助质粒pBSK-L。

（3）将上述转录质粒和转录辅助质粒共转染所述新城疫致弱株可以复制的宿主细胞BHK-21，培养转染后的宿主细胞；