[发明专利]碳青霉烯类抗生素耐药基因检测DNA芯片的制备和用途

说明书

技术领域

本发明涉及碳青霉烯类抗生素耐药基因检测DNA芯片的制备和用途，属于基因芯片检测技术领域。

背景技术

碳青霉烯类抗生素具有广谱、强效、对绝大多数β-内酰胺酶高度稳定、对头孢菌素耐药菌仍可发挥优良抗菌作用的特点。细菌对该类药物不存在交叉耐药性，因而碳青霉烯类抗生素对革兰氏阳性菌、阴性菌及厌氧菌都有强大的抗菌活性，是治疗危重感染或初始抗生素治疗失败的复杂感染的常用抗菌药物之一。碳青霉烯类抗生素在大多数情况下耐受性良好，不良反应发生率较低，适用于严重的革兰阴性菌感染、混合感染、耐药菌感染和免疫缺陷者感染，在抗菌治疗中基本处于最后一道防线的地位

但随着广谱抗生素的广泛使用，世界各地陆续出现了产碳青霉烯酶菌株感染造成的暴发流行，给临床带来了极大的麻烦，因其对临床常用的广谱抗生素均耐药，由此引发的感染往往无药可救，病死率极高。而且耐药菌株一旦无法及时清除，就有可能通过克隆传播引起交叉感染，至造成院内感染的暴发流行。另外，由于肠杆菌科细菌对碳青霉烯耐药主要由质粒介导，耐药基因容易随质粒在不同菌种之间传播，造成耐药性的扩散。因此快速、准确的早期诊断是预防及控制耐药株暴发流行、延缓耐药性的发展的关键。常见的碳青霉烯类耐药检测方法有纸片扩散法、稀释法、Etest(表型确认)、改良Hodge实验、自动化药敏检测(VITEK2系统、BD Phoenix、ATB系统)等。但纸片扩散法和稀释法影响因素多，操作技术误差大；Etest和自动化药敏检测价格昂贵，抗生素选择自由度差，不适用于基层临床单位开展。基因芯片技术具有快速、准确、低成本等特点，适用于碳青霉烯类抗生素耐药基因的高通量检测。

发明内容

本发明的目的在于针对碳青霉烯类抗生素耐药检测领域存在的一些不足，研制一种高通量、特异、敏感、快速的碳青霉烯类抗生素耐药基因检测DNA芯片，能同时检测九种常见的碳青霉烯类耐药基因，包括KPC、NDM-1、OXA-23、OXA-48、OXA-51、IMP、VIM、SIM、DIM，为碳青霉烯类抗生素耐药的临床诊断、表型确证及分子流行病学调查提供一种新的检测手段。

为了达到上述目的，本发明碳青霉烯类抗生素耐药基因检测DNA芯片，其制备方法如下：

1.步骤一：制备碳青霉烯类耐药基因特异性引物

选择碳青霉烯类耐药基因KPC、NDM-1、OXA-23、OXA-48、OXA-51、IMP、VIM、SIM、DIM作为检测基因，优选9对引物序列，如表1所示：

表1 引物序列及对应的扩增靶标

2.步骤二：制备特异性寡核苷酸探针

根据每种碳青霉烯类耐药基因的序列比对，在上下游引物范围内的序列相对特异区进行探针的设计。碳青霉烯类耐药基因各特异性探针序列，如表2所示：

表2 寡核苷酸探针序列及对应的靶标

3.步骤三：制备寡核苷酸芯片

一个优选的实施方案，步骤二中的各个寡核苷酸探针在点样时，用2×点样液(6×SSC，0.1％SDS)稀释至终浓度50μM。用市售的基因芯片点样仪将探针点到空白的醛基化修饰玻片上，探针的点样量均为3nL。寡核苷酸芯片制备完毕后，使用前至少在室温放置干燥18小时。该芯片特征在于寡核苷酸探针阵列中同时包括9种碳青霉烯类耐药基因的16条特异性探针，其探针阵列如表3所示。其中片基质控探针为20T序列，5’端bio标记、3’端NH₂修饰，用来监测醛基片片基质量；A管内标探针为线粒体mtDNA，B管内标探针16s rRNA，用来监测A、B管多重体系质量；阴性探针用来检测有无污染；所有探针的点样量均为3nL，使用前至少在室温放置干燥18小时。

表3 寡核苷酸探针阵列