[发明专利]一种以金钱松叶片为外植体的金钱松植株再生方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种金钱松植株的再生方法，特别是涉及一种以金钱松叶片为外植体的金钱松植株再生方法。

背景技术

金钱松是我国特有的古老孑遗松科树种。根据世界保护联盟(IUCN)新制定的物种受威胁的分类系统标准和中国植物红皮书的标准，金钱松被定为渐危种，并被列为国家二级保护植物。

金钱松既是重要的园林植物，同时更是一种重要的、应用前景广阔的药用植物。研究发现，金钱松最主要的药用成分是从其树皮和根皮中提取出来的二萜类化合物土槿酸，它具有抗肿瘤、抗真菌、抗早孕和使胆囊自截等功效，尤其是抗肿瘤的功效使得金钱松的药用价值更加凸显。现代药理研究发现，土槿酸及其衍生物能作用于多种癌细胞如胃癌细胞、宫颈癌细胞、肺癌细胞、乳腺癌细胞、卵巢癌细胞等，并具有明显的量效关系。

目前金钱松人工种植主要采用有性繁殖和无性繁殖两种方式。有性繁殖即种子繁殖，由于金钱松存在结实率低、结实间隔期较长(一般3～5年结实)、采种条件苛刻(采种母树年龄以100年左右为最好)、种子成活率低(仅为60％-70％)、以及种子需低温保存等因素的限制，因此目前通过有性繁殖大量种植金钱松植物还存在一定的困难。无性繁殖即扦插繁殖，金钱松为菌根性树种，宜在海拔500m左右的山地建立永久性育苗基地或在土内有菌的林间育苗，植物生长周期长，并易受金钱松小卷蛾的严重危害，这些因素限制了金钱松的大量无性繁殖。由于人工种植金钱松植物存在上述问题，因此目前迫切需要利用组织培养技术来大规模生产品质优良的金钱松植物及其培养物，以满足人们对金钱松植物和相关产物的需要。

目前关于对金钱松植物的研究，主要集中在对金钱松有效成分的提取及其内生真菌的筛选方面，而在植物生物技术的研究报道方面，有王跃华等人发明的“一种以叶原基为外植体的金钱松愈伤组织培养方法”(专利号：ZL 201210104866.8)和“一种金钱松细胞的悬浮培养方法”(专利号：ZL 201210472291.5)的研究报道；然而上述两个专利是采用金钱松植物的芽和叶原基为外植体，通过固体和液体两种培养方式，完成了对其愈伤组织的诱导和增殖培养，目前还没有涉及到以金钱松叶片为外植体，经诱导获得愈伤组织后，再进一步完成不定芽的分化和无根苗的生根培养，最后成功培育出金钱松植物的组培苗的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种以金钱松叶片为外植体的金钱松植株再生方法，该方法通过诱导金钱松叶片产生愈伤组织、以及芽分化培养、生根培养和炼苗与移栽等步骤，可获得生长速度快、不带任何病虫害且具有优良性状的金钱松组培苗。

本发明提供的以金钱松叶片为外植体的金钱松植株再生方法包括如下步骤：

(1)外植体的选取和消毒：选取生长健康、无病虫害的金钱松叶片，先用浓度为75％的酒精消毒10～30s，用无菌水冲洗后，再用浓度为0.1％的升汞消毒3～6min，最后用无菌水冲洗后用已灭菌的滤纸吸干表面的水分；

(2)外植体的处理：将消毒后的叶片放在滤纸上，用刀切伤金钱松叶片，伤口以不切断叶片为准；

(3)愈伤组织的诱导培养：将处理后的金钱松叶片接入愈伤组织诱导培养基GD+NAA0.5～1.5mg/L+GA₃0.5～1.5mg/L中进行愈伤组织的诱导培养；

(4)芽分化培养：选取质地较紧密、生长状况良好的愈伤组织，接入芽分化培养基MS+TDZ0.1～0.3mg/L+Ad 10～30mg/L中进行不定芽的诱导培养；

(5)生根培养：当不定芽长至1.0～2.5cm时，将其切下转接到生根培养基1/3MS+IAA0.5～1.5mg/L+活性炭20～40mg/L中进行生根培养；

(6)炼苗和移栽：当组培苗不定根生长健壮时，打开瓶盖，在室内炼苗2～4天后，将其从培养瓶中取出，洗去不定根上的培养基，将其移栽至松软的土壤中生长；

上述所有培养基的pH值5.5～6.7、蔗糖15～50g·L^-1、琼脂4.0～6.0g·L^-1；所有培养条件为：每天光照12～24小时、光照强度为2000～3000lx、培养温度20～30℃。

进一步地，步骤(1)中所述金钱松叶片为刚伸展1～7天的金钱松幼嫩叶片。

进一步地，步骤(1)中用浓度为0.1％的升汞消毒时，每100ml的0.1％升汞溶液中还滴加了5～10ml吐温20。

进一步地，步骤(6)中移栽后的培养条件为适当遮光，温度保持在20～28℃，相对湿度保持在75～85％。