[发明专利]一种基于无偏识别与恒温扩增的小RNA检测试剂盒及定量方法

权利要求书

1.基于无偏识别与恒温扩增的小RNA检测试剂盒，其特征在于，包括：

与目标小RNA形成三元杂交结构的组合物，包括3-WJ引物和3-WJ模板：

3-WJ引物由两部分序列组成，5'端部分与目标小RNA 3'端部分互补，3'端部分与3-WJ模板的中间段互补；

3-WJ模板由三部分序列组成，3'端部分与目标小RNA 5'端部分互补，中间段与3-WJ引物3'端部分互补，5'端部分为含两个核酸切口酶识别位点的链置换扩增SDA模板区域，其中一个切口酶识别位点经过硫代修饰；

扩增底物，包括dNTPs混合物；

工具酶，包括具有链置换扩增活性的DNA聚合酶和核酸切口酶，用于触发SDA产生带有内切酶位点的SDA产物；

带有茎环结构的分子信标探针，其两端分别标记有荧光基团和猝灭基团，分子信标探针具有能够与SDA产物相互补的序列；与SDA产物互补的分子信标探针序列中含有核酸切口酶Nt.BbvCI的酶切位点；

以及扩增反应缓冲液；缓冲液包括：KAc、Tris-HAc、Mg(Ac)₂及DTT；

3-WJ引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；含有酶切位点的硫代修饰的3-WJ模板的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示；

分子信标探针的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示；其两端分别标记有荧光基团FAM和淬灭基团DABCYL。

2.根据权利要求1所述的基于无偏识别与恒温扩增的小RNA检测试剂盒，其特征在于，小RNA检测试剂盒中包括：10nM 3-WJ引物，10nM 3-WJ模板，250uM dNTPs，250nM分子信标探针，0.5U DNA聚合酶，2.5U核酸切口酶，50mM KAc，10mM Tris-HAc，10mM Mg(Ac)₂及1mM DTT。

3.根据权利要求1所述的基于无偏识别与恒温扩增的小RNA检测试剂盒，其特征在于，3-WJ引物与3-WJ模板的摩尔比为1:1；且3-WJ引物与3-WJ模板有6个碱基的互补。

4.一种基于无偏识别与恒温扩增的小RNA定量方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取获得待测目标小RNA；

2)通过核酸互补杂交，目标小RNA特异性识别3-WJ引物、3-WJ模板并形成稳定的三元杂交结构；

其中，3-WJ引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；

3-WJ模板的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示；

3)将三元杂交结构与扩增底物、工具酶、分子信标探针以及扩增反应缓冲液混合，三元杂交结构中的三元引物沿着硫代修饰的三元模板起始链置换扩增反应，产生大量带有酶切位点的单链SDA产物；

4)扩增获得的单链SDA产物触发打开分子信标的茎环结构，恢复荧光；分子信标与SDA产物形成的双链互补结构中含有核酸切口酶识别位点，在形成双链结构后，该核酸切口酶识别位点被识别，并在分子信标序列上进行切割；被切割的分子信标从双链结构上脱落产生荧光信号，SDA产物与新的分子信标形成杂交双链，以产生更多的荧光信号；

5)待达到规定的反应时间后，检测荧光信号，对荧光信号分析，得到待测溶液中小RNA的含量。

5.根据权利要求4所述的基于无偏识别与恒温扩增的小RNA定量方法，其特征在于，在3-WJ模板的SDA模板区域中含有两个Nt.BbvCI的识别位点，包括硫代修饰不被切割的序列5’-CCTCAGC-3’和能够被切口酶识别并切割的5’-GCTGAGG-3’；

靠近模板3’端的位点在SDA生成双链的过程中被Nt.BbvCI识别，在聚合产物位点处切割实现SDA；

靠近模板5’端的位点被硫代修饰，阻断第二次Nt.BbvCI酶切，在产生大量带有酶切位点的SDA产物的同时模板不被酶切。

6.根据权利要求4所述的基于无偏识别与恒温扩增的小RNA定量方法，其特征在于，步骤3)所述的扩增反应中温度为37℃，反应时间为45分钟。