[发明专利]一种核苷酸序列及其在提高菌株耐酸性中的应用

说明书

本发明公开了一种核苷酸序列，该核苷酸为全局转录调控因子的基因序列，本发明还公开了该核苷酸序列在提高菌株耐酸性中的应用。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种核苷酸序列及其在提高菌株耐酸性中的应用。

背景技术

细胞对酸胁迫的抗性差是传统发酵工业节能减排的关键共性问题。有机酸、氨基酸产业作为我国发酵产业的重要组成部分，其目的产物导致了不利于细胞生长与维持正常代谢活性的酸性微环境，并严重影响了生产条件稳定性的维持。迄今为止，绝大多数工业微生物的耐酸研究都集中在大规模的诱变和筛选，研究周期长、工作量大，且属于暗箱操作，不能根据目标表型获得相应的基因型，即不清楚突变发生的位置和机理。因此，研究微生物酸耐受性机制，提高微生物对酸耐受性十分重要。目前研究表明，工业微生物的耐酸机制同时涉及有机酸的跨膜运输、体内协同转运、以及与能量因子偶联等多种作用形式，是个复杂的科学问题。

大肠杆菌基因组共含有4000多个基因，这些基因的转录特异性受到两步调控：第一步就是RNA聚合酶σ因子的转录识别，第二步是约240-260个其他特异性转录因子的识别。在大肠杆菌的不同生长环境中，其RNA聚合酶是通过转录特异基因的选择性σ因子改变基因组的转录来调控整个生长过程。目前大肠杆菌中发现的σ因子有7种，分别为：σ^D（σ⁷⁰）、σ^N（σ⁵⁴）、σ^S（σ³⁸）、σ^H（σ³²）、σ^F（σ²⁸）、σ^E（σ²⁴）和σ^fecI。其中，σ^D是最主要的σ因子，负责与细胞生长相关的1000多个基因的转录控制，是提高大肠杆菌耐酸性的最佳对象。

随机片段交换法是一种新的突变文库构建方法，它汇集了多种DNA序列的突变形式，各种形式可以单独发生，也可以同时发生。2006年，Fujii等利用此方法对TEM-1型β-内酰胺酶进行进化，经过三轮突变，使其对头孢他啶（ceftazidime）的最小抑制浓度提高了5000倍。因此，将随机片段交换法替代易错PCR构建基因突变文库方法，不仅可以简化实验操作步骤，同时又能增强突变文库的多样性，将大大提高工业微生物耐酸表型定向筛选的效率。

发明内容

本发明的目的是通过突变全局转录调控因子σ^D，筛选得到能够提高大肠杆菌耐酸性的突变菌株，并获得该转录调控因子的多核苷酸序列。

为了达到本发明的技术目的，发明人以携带rpoD基因(gene ID 947567)完整序列（含上游天然启动子区域和下游终止子区域）的大肠杆菌E. coli DH5 alpha基因组为模板，构建rpoD基因的突变文库。将以随机片段交换法获得的rpoD突变基因为目的片段，以低拷贝表达质粒pKSC为载体，通过T4DNA连接酶连接，得到带有rpoD突变基因的重组质粒，经热激法转化E. coli DH5 alpha感受态细胞，涂布含有30 μg/mL卡那霉素的LB平板，37℃培养过夜。洗脱单菌落，利用平板试管交替筛选的模式，最后筛选得到显著提高大肠杆菌酸耐酸性的trpoD。