[发明专利]分子标志物用于乳腺癌诊断和预后评估的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术和医学领域， 涉及一种分子标志物用于乳腺癌诊断和预后评估的方法。

背景技术

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一， 发病率占全身各种恶性肿瘤的 7-10%，位居女性恶性肿瘤发病率的第一位。 近十几年来我国乳腺癌发病率逐年上升,且发病年龄趋于年轻,已严重威胁我国妇女的健康。乳腺癌作为高度分子异质性疾病， 沿用的解剖学分期和组织学分类已不能满足其目前的临床诊治需求， 尤其缺少能够标志肿瘤生物学行为并对临床治疗提供指导作用的乳腺癌组织学分类方法。近年来， 人们尝试采用各种高通量分子技术方法认识乳腺癌内在本质。目前较为公认的是将乳腺癌分为 4个类型， 即管腔上皮（表达正常乳腺管腔上皮激素受体、细胞角蛋白和相关基因）A 型（Luminal A）、管腔上皮 B型（Luminal B， 较 A 型激素受体水平低， 组织学级别高）、HER-2 过表达型和基底样型（basal-like， 表达乳腺上皮基底样或干细胞相关基因）。这4 种类型在之后大量的临床研究中， 证实了它们在预后和治疗反应等方面具有特异性。

S100A8 蛋 白 (Calgranulin A 蛋 白 、MRP8 蛋 白 ) 与 S100A9蛋 白 （Calgranulin B 蛋 白 、MRP14 蛋 白 ） 均 属 于 钙 结 合 蛋 白S100 蛋白家族成员 ， 两者常以钙离子依赖性方式形成异源二聚体 S100A8/A9 蛋 白 复 合 物（ 简 称 S100A8/A9），在循环中性粒细胞、 单核巨噬细胞中表达。可参与炎症反应，调节细胞生长分化，增长抑制 ，诱导细胞凋亡等。近年来的研究发现S100A8/A9与多种疾病密切相关，特别是其对于肿瘤性疾病增殖和凋亡的可能作用。但目前尚无其应用于乳腺癌诊断和预后的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种分子标志物用于乳腺癌诊断和预后评估的方法。所述的分子标志物可用于帮助乳腺癌进行基因分型及预后评估。

本发明所述的技术方案是：

（1）对患有乳腺癌的对象进行基因分型测定：从患有乳腺癌的对象获得测试样品；测定S100A8和S100A9在所述测试样品中的表达水平；分析表达水平与乳腺癌基因分型的相关性：乳腺癌基底细胞型（basal-like） 和 Her-2 过表达型（Her-2 amplified）的S100A8和S100A9的表达水平高，而管腔上皮A型（Luminal A）和 管腔上皮B型(Luminal B)亚型中表达量较低。

（2）对患有乳腺癌的对象进行预后评估：根据乳腺癌微阵列数据，通过对对象的S100A8和S100A9 表达水平进行分组，从而分析表达水平与乳腺癌预后水平的相关性。S100A9的表达水平高的对象预后存活差；S100A9的表达水平低的对象预后存活良好。

所述的基因分型测定方法为：

1）RNA提取和逆转录

获得乳腺癌患者手术后的组织，分离 mRNA，将每个样本1 μg的RNA在20 μL的体系中逆转录成cDNA；

2）qRT-PCR

用SYBR法，以cDNA为模板，扩增目的基因S100A8和S100A9，以β-actin 基因做内对照；反应体系为25 μL，反应程序为：预变性 95℃， 10min； 循 环 95℃， 15sec， 60℃， 1min，共 40 个循环；基因相对表达量采用公式 2-△△ct 计算，分析目的基因表达量的差异；

所述的分离 mRNA，用英骏公司（Invitrogen） 的纯化试剂盒、缓冲液组和蛋白酶；

所述的乳腺癌微阵列数据采用的是荷兰癌症研究所（Netherlands Cancer Institute, NKI）中的发表的乳腺癌微阵列数据。

本发明的优点是：本发明通过采用乳腺癌标志物S100A8/A9对乳腺癌进行诊断和预后评估具有操作简单、特异性高、灵敏性高的优点。

附图说明

图1为NKI陈列中不同类型的乳腺癌基因分型的S100A8和S100A9的表达水平。

图2为基因表达相关性分析，其中(A)为S100A8和ESR1（雌激素受体alpha）；(B) 为S100A8和GATA-3；(C) 为S100A9和ESR1（雌激素受体alpha）；(D) 为S100A9和GATA-3。

图3为根据NKI数据库中乳腺癌患者的S100A8和S100A9表达水平分组后的 Kaplan-Meier存活分析曲线。

图4为qRT-PCR引物序列。