[发明专利]一种在苗期鉴定抗冻结球白菜的方法

权利要求书

1.一种在苗期鉴定抗冻结球白菜的方法，其特征在于它包括如下步骤：

（1）将结球白菜种子播种到育苗盘中育苗；待幼苗长至5~6片真叶时在人工气候箱内对幼苗进行冷驯化处理；

（2）在经冷驯化处理的结球白菜幼苗上取叶圆片，称取3份叶圆片样品，分别置于圆底管中用液氮快速冷冻；用研磨棒在冰冻条件下将样品磨碎，加入预冷却的甲醇摇匀；加入核糖醇作为内标摇匀；使用热混合器提取并进行离心处理；转移上清液到另一玻璃管中，加入预冷却的氯仿摇匀；加入预冷却的双蒸水摇匀；进行离心处理后转移上清液到另一干净的玻璃管中，将样品室温真空干燥；

（3）衍生化处理：向真空干燥过的样品中加入甲氧氨基化试剂反应并持续振荡；然后将硅烷化试剂N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺加入样品反应管中振荡反应；

（4）GC-MS分析：转移衍生化好的样品到适合GC-MS分析的内衬管中进行GC-MS分析；

    （5）数据处理：将GC-MS分析获得的数据生成谱图并积分，采用内标法对样品中苹果酸、果糖和甘露糖进行定量，将3份样品取平均值，计算结球白菜苹果酸、果糖和甘露糖含量；选取苹果酸、果糖和甘露糖含量达标的结球白菜幼苗作为抗冻材料移栽到大田用于杂交育种或留种。

2.根据权利要求1所述的在苗期鉴定抗冻结球白菜的方法，其特征在于：所述冷驯化处理是将幼苗放入人工气候箱内在4℃下进行冷驯化，处理期间光周期为光照12h，光照强度15000 Lx；暗期12h；相对湿度控制在65%左右，试验处理10天。

3.根据权利要求1所述的在苗期鉴定抗冻结球白菜的方法，其特征在于：所述称取3份样品是在经冷驯化处理的结球白菜幼苗第3叶主脉两侧取叶圆片，称取100mg样品3份。

4.根据权利要求1所述的在苗期鉴定抗冻结球白菜的方法，其特征在于：步骤（3）中衍生化处理的条件为：加玻璃管中的样品中40μl甲氧氨基化试剂，37℃反应2h，持续振荡；将70μl硅烷化试剂N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺MSTFA加入样品反应管中，37℃振荡反应30min。

5.根据权利要求1所述的在苗期鉴定抗冻结球白菜的方法，其特征在于：步骤（4）中GC-MS分析气相色谱条件: GC进样口温度为280℃；采用升温程序: 初始柱温60℃, 保持4分钟; 以每分钟8℃升至315℃; 在315℃维持7分钟；质谱条件: 离子源为电子轰击EI源, 激发电压为70 eV, 离子源温度为300℃, 四级杆温度为150℃,扫描范围50–650 m·z–1, 扫描速度为每秒0.5 scans，扫描时间4.5–41.8分钟；进样量1μL。

6.根据权利要求1所述的在苗期鉴定抗冻结球白菜的方法，其特征在于：步骤（5）中筛选出的抗冻材料的标准为苹果酸含量大于1000μg/g·FW，甘露糖含量大于2000μg/g·FW，果糖含量大于1800μg/g·FW。