[发明专利]从猪小肠黏膜肝素提取后废弃液中制备脱氧核糖核酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及从动物组织制备脱氧核糖核酸领域，尤其是一种利用猪小肠黏膜肝素提取后的废弃液中制备脱氧核糖核酸的方法。

背景技术

核酸是生命的最基本物质之一，它广泛存在于所有动物、植物细胞、微生物内，生物体内核酸常与蛋白质结合形成核蛋白。不同的核酸，其化学组成、核苷酸排列顺序等不同。根据化学组成不同，核酸可分为核糖核酸(简称RNA)和脱氧核糖核酸(简称DNA)。

DNA是储存、复制和传递遗传信息的主要物质，在生物体的个体生长、发育、繁殖、遗传等各个环节起着重要作用，有促进细胞生长、增强细胞活力及改善机体代谢等作用。随着人类对DNA研究的不断深入，发现其对众多重大疾病的治疗、治疗后恢复、营养保健等方面有积极的作用，不同生物组织中提取的DNA可用于：(1)增强免疫功能；(2)治疗急、慢性肝炎及治疗后恢复；(3)治疗白细胞减少症，包括肿瘤患者放疗、化疗后的白细胞减少；(4)治疗血小板减少症、贫血及再生障碍性贫血等疾病；(5)治疗冠心病、心肌梗塞、心肌炎；(6)促进大面积创伤的修复；(7)抗衰老；(8)各种慢性消耗性疾病营养补充等。因此，近年来核酸物质需求量很大，如：欧洲对核酸的需求额从2005年6.7亿美元增加到2012年的14.9亿美元，从事核酸类相关技术研究意义重大，产品的市场需求很大。在核酸制备技术方面，八十年代前后主要从小牛胸腺和鱼类精囊中提取，九十年代后，由于该类货源紧缺，限制了DNA的生产；由于生物发酵法生产DNA技术难度大、成本很高，近年来从动物废弃物中提取DNA成为研究的热点。如：中国专利(申请号：200410016960.3)披露了一种从猪、羊、鸡和鸭的胸腺中提取脱氧核苷酸方法，惠长野等开展了从猪小肠黏膜中提取脱氧核糖核酸的研究(沈阳药科大学学报,2013,30(1):63-67)。

我国是全球肝素粗品和肝素原料药的生产大国和出口国，而制取肝素的原料主要以猪小肠黏膜为主。肠粘膜提取肝素后有大量废弃物产生，废弃物的排放不仅造成环境污染，同时废弃物中具有医疗保健作用的活性物质也被浪费。因此，对废弃物进行利用，从中提取高附加值的脱氧核糖核酸，不仅能减轻环境污染，而且可以实现废弃物的综合利用，提高经济效益，也是本发明的意义所在。

发明内容

针对脱氧核苷酸提取原料紧缺的现状，以及猪小肠黏膜肝素提取过程中废弃物随意排放、造成资源浪费的现象，本发明的目的在于提供一种从猪小肠黏膜肝素提取后废弃液中制备脱氧核糖核酸的方法，该方法可实现猪小肠粘膜综合利用，提高产品附加值，为脱氧核糖核酸的制备提供新来源，缓解原料短缺的现状。

为实现上述发明目的，本发明的技术方案是：

一种从猪小肠黏膜肝素提取后废弃液中制备脱氧核糖核酸的方法，该方法包括以下步骤：

(1)柱吸附：将离子交换树脂装入吸附柱中，用泵将猪小肠黏膜肝素提取后废弃液通过含有树脂的吸附柱进行吸附；

(2)脱附：用浓度为0.05～0.2mol/L的氯化钠洗脱吸附柱，用温度为60～70℃浓度为2.0～4.0mol/L的氯化钠溶液洗脱，收集脱附液；

(3)酸沉：将收集的脱附液调节pH至1～3，静置；

(4)复溶：将(3)中混合液进行离心，收集沉淀，用蒸馏水清洗沉淀2～4次，加入蒸馏水，搅拌下加入碱溶液，使沉淀溶解；

(5)醇沉：加入体积分数为90％～95％的乙醇进行沉淀，静置12～24h，去掉上清液，收集下层沉淀；

(6)透析：将(5)中沉淀溶于37～55℃蒸馏水中，转入透析袋中，透析，去除小分子物质，透析结束后，将透析内液进行旋蒸浓缩，冻干，获得脱氧核糖核酸。

所述的从猪小肠黏膜肝素提取后废弃液中制备脱氧核糖核酸的方法，该方法所获得的脱氧核糖核酸的分子量分布范围为3～70kDa之间。

所述的从猪小肠黏膜肝素提取后废弃液中制备脱氧核糖核酸的方法，步骤(1)中，吸附所用的树脂为罗门哈斯AMBERLITE FPA 98 CL树脂，猪小肠黏膜肝素提取后废弃液与树脂的重量比为700～1200:1。

所述的从猪小肠黏膜肝素提取后废弃液中制备脱氧核糖核酸的方法，步骤(2)中，清洗吸附柱所用0.05～0.2mol/L的氯化钠溶液体积为吸附柱体积的2～3倍，脱附所用的2.0～4.0mol/L氯化钠溶液体积为吸附柱体积的1.5～3倍。

所述的从猪小肠黏膜肝素提取后废弃液中制备脱氧核糖核酸的方法，步骤(3)中，调节脱附液pH值时采用的酸为1～3mol/L的盐酸，边搅拌边加酸，静置温度为4～8℃，时间为4～12h。