[发明专利]一种胎盘造血干细胞的制备方法

权利要求书

1.一种胎盘造血干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、胎盘预处理后，用灌洗液灌注清洗胎盘；

步骤2、将动员剂从胎盘动脉灌注至胎盘静脉流出动员剂停止并结扎胎盘动静脉静置，所述动员剂为包括0.3-3mg/L AMD3100、1倍的枸橼酸盐缓冲溶液、1倍的青-链霉素双抗、0.01-0.1mg/mL的罂粟碱、 0.5-2mmol/L的N-乙酰半胱氨酸、0.3mg/mL维生素C和50ng/mL的Z-VAD-FMK的DMEM高糖基础培养基；其中，5倍枸橼酸盐缓冲液配制方法，如下：

称取枸橼酸钠粉末26.3g、枸橼酸粉末3.27g、葡萄糖12.7g、磷酸二氢钠 4.44g、腺嘌呤0.55g，把上述各组分溶于400mL的去离子水中，充分搅拌混匀后形成5倍枸橼酸盐缓冲溶液，0.22μm过滤，分装；稀释配置成1倍的枸橼酸盐缓冲溶液使用；

步骤3、松开胎盘动静脉并从动脉灌注与步骤2同量的动员剂，从静脉处收集全部液体，离心取细胞沉淀，然后依次经羟乙基淀粉法和红细胞裂解法回收纯化包含造血干细胞的单个核细胞，重悬后获得所述胎盘造血干细胞。

2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤1所述灌洗液灌注清洗胎盘为：

将0-4℃灌洗液灌注进胎盘中的动脉，直至胎盘内血清清洗干净。

3.根据权利要求1或2所述制备方法，其特征在于，所述灌洗液为包括青-链霉素双抗、EDTA、枸橼酸盐缓冲溶液、罂粟碱和N-乙酰半胱氨酸的PBS缓冲液。

4.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，所述灌洗液为包括1-3倍的青-链霉素双抗、0.01-0.04% EDTA、1倍的枸橼酸盐缓冲溶液、0.01-0.1mg/mL的罂粟碱和0.5-2mmol/L的N-乙酰半胱氨酸的pH值为7.0的PBS缓冲液；5倍枸橼酸盐缓冲液配制方法，如下：

称取枸橼酸钠粉末26.3g、枸橼酸粉末3.27g、葡萄糖12.7g、磷酸二氢钠 4.44g、腺嘌呤0.55g，把上述各组分溶于400mL的去离子水中，充分搅拌混匀后形成5倍枸橼酸盐缓冲溶液，0.22μm过滤，分装。

5.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述预处理为剥离羊膜并用灌洗液清洗胎盘。

6.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述羟乙基淀粉法具体步骤为：

将细胞沉淀和羟乙基淀粉按体积比细胞沉淀：羟乙基淀粉=1:1-3的比例，用羟乙基淀粉重悬细胞沉淀，室温下静置20-40min，吸取上清离心，离心后弃上清。

7.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述红细胞裂解法具体步骤为：

将经羟乙基淀粉法处理后的细胞沉淀和1倍的红细胞裂解液，按体积比细胞沉淀：1倍红细胞裂解液=1:5-10的比例，用1倍的红细胞裂解液重悬细胞沉淀，涡旋振荡5s，室温下裂解残留的红细胞10min，离心后弃上清获得包含造血干细胞的单个核细胞。

8.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤3所述重悬以DMEM高糖基础培养基重悬。