[发明专利]一种基于双酶修饰电极快速检测溶液中氨基甲酸乙酯含量的电化学方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用双酶修饰电极快速检测溶液中氨基甲酸乙酯含量的电化学方法，属于分析化学、食品安全检测技术领域。

背景技术

氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate，C₂H₅OCONH₂，CAS#51-79-6，简称EC)，是广泛存在于发酵食品及酒类饮料中的一种副产物。通过对猴子、小白鼠、仓鼠、老鼠等实验研究证明，EC是一种具有遗传毒性和致癌作用的物质，能够迅速被胃肠束和皮肤快速吸收，可导致肺癌、淋巴癌、肝癌和皮肤癌等疾病。主要通过酒精类饮料如黄酒、清酒、葡萄酒、苹果酒、白兰地或威士忌等摄入人体内并积累，通过细胞色素P450的代谢而对人体产生致癌作用。基于以上流行病学和实验数据，EC被国际癌症组织和美国环境保护署定义为可能的人类致癌物质(2B)，至2007年，被重新归类为对人类具有致癌作用的2A类致癌物质。鉴于此，世界好多国家先后对饮料酒中氨基甲酸乙酯含量做了限量标准。

我国人口基数大，每年会生产和消费大量的发酵酒和食品，如米酒、白酒、啤酒和酱油、醋、腐乳等。这就意味着我国会因为大量酒精类饮料和发酵类食品的摄入而积累过量的EC。因此，亟须提出控制和减少我国发酵类食品和酒精类饮料中EC含量的方法和策略，同时需要开发出精确、简便、廉价、省时的检测方法也势在必行。

目前，国内外普遍采用的氨基甲酸乙酯含量检测的方法是基于气质联用(GC-MS)、高效液相层析(HPLC)等结合其他灵敏性较强的检测器方法，如液相色谱-电喷射串联质谱(HPLC-EIS-MS/MS)、高效液相层析-荧光检测器(HPLC-FLD)、正向液相色谱-气压化学电离串联质谱(NP-LC-APCI-MS/MS)、多维顶空固相微萃取结合气相色谱和火焰离子化检测器(HS-SPME/GC/FID)、一维气相色谱-质谱(MEPS/GC-MS)、高效液相色谱结合Q Exactive杂合四极-轨道阱质谱(UHPLC-MS/MS)等。这些方法虽然能够在一定程度上对酒类饮料中氨基甲酸乙酯含量进行检测，但是大多需要对样品进行预处理，操作繁杂、耗时耗力、重现性差、操作系统误差大，同时需要二氯甲烷等有机溶剂萃取和洗脱，对操作人员的健康存在安全隐患。另外，萃取过程中会用到大量的有机溶剂，从而需要蒸发去除有机溶剂，导致分离效果较差而影响样品的回收率和检测结果的准确性。最重要的是，这些方法所需的各种监测分析系统需要以大型精密仪器作支持，需要专业的操作人员。同时还伴随着对检测仪器要求高，对仪器的维修和护理成本高，只能在具有大型、贵重仪器的专业实验室内进行检测，难以推广使用等问题。

随着生物传感器的发展，双酶和多酶联用的生物传感器逐渐引起人们关注并得到了广泛的应用。现阶段已有许多酶传感器用于水体中氨、尿素、重金属离子、过氧化氢、苯酚、有机磷杀虫剂、抗坏血酸、谷氨酸以及其他氨基酸的检测。但目前还没有报道用于检测EC含量的酶传感器。本发明在前期筛选出产氨基甲酸乙酯降解酶的菌株的基础上，构建了氨基甲酸乙酯降解酶和谷氨酸脱氢酶双酶修饰电极传感器实现对EC的快速检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速检测溶液中氨基甲酸乙酯含量的电化学方法，要解决的技术问题是构建检测氨基甲酸乙酯所需要的双酶修饰电极传感器。固定在电极表面的氨基甲酸乙酯降解酶(Urethanase, Ure)能够水解氨基甲酸乙酯产生乙醇、CO₂和NH₄⁺，在谷氨酸脱氢酶(Glutamate dehydrogenase, GLDH)的催化下氨与共底物α-酮戊二酸反应生成谷氨酸，同时伴随着还原型辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）被氧化。从而该体系将氨基甲酸乙酯含量转化成NADH含量的变化，利用NADH在施加一定电压后于电极表面产生电流响应值的变化，实现对液态体系中氨基甲酸乙酯含量的检测。

本发明的技术方案：一种快速检测溶液中氨基甲酸乙酯含量的电化学方法，其特征在于利用氨基甲酸乙酯降解酶和谷氨酸脱氢酶催化的级联反应将氨基甲酸乙酯EC信号转换成还原型辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH信号进行电化学检测，氨基甲酸乙酯降解酶Ure将氨基甲酸乙酯水解生成乙醇、CO₂和氨，在谷氨酸脱氢酶GLDH催化下氨与共底物α-酮戊二酸反应生成谷氨酸，同时伴随着NADH被氧化，利用特定电压下NADH在电极表面氧化产生电流信号的变化，对氨基甲酸乙酯含量进行电化学检测；步骤为：

（1）构建双酶修饰电极