[发明专利]一种叶酸代谢能力评估的检测位点rs1801394的检测PCR扩增引物和单碱基延伸引物

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于叶酸代谢水平评估的飞行质谱生物芯片及检测方法和试剂盒。

背景技术

叶酸在新鲜绿叶蔬菜中含量最多，食物中的叶酸经过胆汁和小肠中的γ-谷氨基羧肽酶(γ-glutamyl carboxypeptidase)水解成蝶酰单谷氨酸和二谷氨酸始能吸收。吸收的叶酸以N5-甲基四氢叶酸的形式存在于血中，和白蛋白疏松结合运输，通过叶酸受体被摄取进入细胞内，在维生素B12依赖的蛋氨酸合成酶作用下形成四氢叶酸而发挥作用。四氢叶酸在体内转移一碳基团等过程中起辅酶作用。丝氨酸是一碳基团的来源，它和四氢叶酸作用形成N5。10-甲烯基四氢叶酸和甘氨酸；另一来源系在组氨酸分解代谢中的亚氨甲酰谷氨酸和四氢叶酸作用生成N5-亚氨甲酰四氢叶酸和谷氨酸。

MTHFR为亚甲基四氢叶酸还原酶蛋白编码基因，主要作用是在叶酸代谢通路中将5，10-亚甲基四氢叶酸转化为具有生物学功能的5-甲基四氢叶酸。5-甲基四氢叶酸可以进一步进入甲基传递通路，通过同型半胱氨酸的重新甲基化过程间接为DNA甲基化和蛋白质甲基化提供甲基并且使血液中的同型半胱氨酸水平保持在一个较低的水平。此外叶酸的中间代谢产物在核苷酸合成过程中也有重要的作用，通过一碳单位代谢为嘌呤环的形成提供碳原子。

甲硫氨酸是蛋白质合成和一碳代谢的必需氨基酸，它的合成是由甲硫氨酸合成酶(MTR基因编码)催化的，MTRR编码的甲硫氨酸合成酶还原酶能够通过还原型甲基化作用重新生成具有功能活性的甲硫氨酸合成酶。

单核苷酸多态(SNP)，属于DNA多态性的一种，指DNA序列中发生频率大于1％的单碱基变异，包括单碱基转换，颠换，插入或缺失等变化。SNP作为一种常见的遗传变异，可能导致个体表型的差异以及不同个体对疾病，特别是复杂疾病的易感性，以及对环境因素和药物及治疗反应的差异。研究表明，MTHFR和MTRR基因缺陷的孕妇人群尤其需要补充叶酸，因此，检测孕妇人群的MTHFR和MTRR基因SNP位点，尤其是MTHFR C677T rs1801133、MTRR A1298C rs1801131、酸甲硫氨酸合成酶还原酶MTRR A66G rs1801394位点，可作为补充叶酸的个性化膳食建议依据。

MassARRAY基因分析技术基于MALDI-TOF(基质辅助激光解吸电离)飞行时间质谱技术。先通过PCR扩增目标序列，然后加入SNP序列特异延伸引物，在SNP位点上延伸1个碱基。将制备的样品分析物与芯片基质共结晶，将该晶体放入质谱仪的真空管，而后用瞬时纳秒(10sec)强激光激发，由于基质分子经辐射所吸收的能量，导致能量蓄积并迅速产热，从而使基质晶体升华，核酸分子就会解吸附并转变为亚稳态离子，产生的离子多为单电荷离子，这些单电荷离子在加速电场中获得相同的动能，进而在一非电场漂移区内按照其质荷比率加以分离，在真空小管中飞行到达检测器。MALDI产生的离子用飞行时间(Time-of-Flight，TOF)检测器来检测，离子质量越小，就越快到达。利用质谱分析对质量的灵敏度特别高的特点，很容易将仅含有一个不同碱基的两段基因序列区别开，推导出SNP分型。

发明内容

为了解决上述的技术问题，本发明的第一个目的是提供一种叶酸代谢能力评估的检测位点rs1801394的检测PCR扩增引物和单碱基延伸引物。第二个目的是提供一种用于叶酸代谢能力评估的检测方法。本发明的第三个目的是提供一种用于叶酸代谢能力评估的飞行质谱生物芯片。本发明的第四个目的是提供一种用于叶酸代谢能力评估的试剂盒及其使用方法。

为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案：

一种叶酸代谢能力评估的检测位点rs1801394的检测PCR扩增引物和单碱基延伸引物，PCR扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5、SEQ ID No.6所示，单碱基延伸引物核苷酸序列如SEQ ID No.9所示。

为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案：

一种用于叶酸代谢能力评估的检测方法，该方法检测rs1801131、rs1801133和rs1801394中至少一种，包括如下步骤：

1)以受检者样本DNA为模板，加入PCR扩增引物对以及单碱基延伸引物进行PCR扩增反应；

用于检测rs1801131的PCR扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2所示，单碱基延伸引物核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；