[发明专利]一种调控光滑球拟酵母耐酸胁迫能力的转录因子Asg1p

说明书

技术领域

本发明涉及一种调控光滑球拟酵母耐酸胁迫能力的转录因子Asg1p，属于生物工程领域。

背景技术

光滑球拟酵母(Candida glabrata)是工业生产丙酮酸的唯一微生物。除此之外，C.glabrata还可用于工业生产富马酸、苹果酸、α-酮戊二酸等有机酸。有机酸发酵过程中，随着产物的积累，培养基的pH迅速降低，导致菌体的生长和产物的积累减缓甚至停止。近年来国内外主要通过外源添加辅助底物、诱变育种、基因工程和适应性进化等策略提高菌体的酸耐受性和有机酸产量。对C.glabrata进行耐酸机制的研究可从根本上解决这一问题，但此机制尚不清楚。因此，进行光滑球拟酵母酸胁迫耐受机制的研究很有必要，这对提高有机酸产量具有指导意义。

目前对光滑球拟酵母酸胁迫的研究尚未广泛开展，蛋白质组学分析发现相对于高pH来说，光滑球拟酵母对低pH环境有更强的耐受性。对GPI锚定天冬氨酰蛋白酶的研究发现光滑球拟酵母可通过CgYps1调节质子泵CgPma1的活性以适应酸胁迫环境。

本发明旨在鉴定一种调控光滑球拟酵母耐酸胁迫能力的转录因子Asg1p。

发明内容

本发明提供了一种调控光滑球拟酵母耐酸胁迫能力的转录因子Asg1p，编码所述转录因子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

敲除光滑球拟酵母的编码所述转录因子Asg1p的基因CgASG1，获得缺失CgASG1基因的突变菌株Cgasg1Δ，突变菌株的生长能力和对酸性环境的耐受能力都明显下降；尤其是在pH 2.0的条件下，突变菌株的H⁺-ATPase活性降低，引起胞内酸化，进而造成胞内ROS含量升高。基因CgASG1回补菌株Cgasg1Δ/CgASG1表现出与野生型菌株wt相同的H⁺-ATPase活性、pH_in和ROS水平，在各培养基上均表现出与野生型菌株wt相同的生长表型。

应用所述转录因子Asg1p调控光滑球拟酵母的耐酸胁迫性能，可以是调节光滑球拟酵母中基因CgASG1及转录因子Asg1p靶基因的表达水平，以改变其耐受酸胁迫的能力及有机酸的产量。

本发明提供的一种参与光滑球拟酵母酸胁迫的转录因子Asg1p，其功能是在细胞生长及酸胁迫耐受中发挥重要作用，敲除该转录因子，酵母的H⁺-ATPase活性降低，引起胞内酸化，进而造成胞内ROS含量升高，使得酵母的生长及耐酸胁迫能力下降。本发明提供的该调控光滑球拟酵母耐酸胁迫能力的转录因子Asg1p，能用于构建抗酸胁迫的有机酸生产菌株。

附图说明

图1基因缺失菌株的构建及验证，A敲除框的构建，B基因缺失菌株的验证；

M1、M2泳道分别代表2000bp和10000bp的DNAmarker；+/-泳道代表分别以菌株wt基因组和水为模板进行PCR的对照；1、2泳道分别代表菌株wt和突变菌株Cgasg1Δ的阳性转化子基因组；3、4泳道分别代表使用引物P7/P8进行的PCR验证。

图2基因回补菌株的构建及验证，A目的基因的扩增，B基因回补菌株的验证；

M2泳道代表10000bp的DNAmarker；+/-泳道代表分别以基因CgASG1和水为模板进行PCR的对照；1泳道代表CgASG1基因片段；2泳道代表Cgasg1Δ/CgASG1阳性转化子的菌落PCR验证。

图3光滑球拟酵母生长的测定，A非发酵性碳源上的平板生长实验，B不同pH下的平板生长实验

图4胞内微环境测定结果，A H⁺-ATPase活性，B胞内pH，C胞内ROS含量

具体实施方式

以下是光滑球拟酵母(Candida glabrata)菌株构建及验证、生长性能分析及胞内微环境测定的实施例。

平板生长实验：将待测菌株的单菌落接种于20mL的YNB(0.67％不含氨基酸的YNB，2％葡萄糖，pH 5.2)液体培养基中，30℃摇床培养12h至对数生长期，测定菌体浓度并将菌悬液调节至OD₆₀₀＝l.0，以此为初始浓度，进行5次10倍梯度稀释，依次将4μL菌液点种在不同碳源的YNB(0.67％不含氨基酸的YNB，图3A中相应的碳源)和不同pH的YNB(0.67％不含氨基酸的YNB，2％葡萄糖，pH 3.0和pH 2.0)固体培养基上，30℃培养2天，观察菌体的生长情况并拍照。