[发明专利]表达猪传染性胃肠炎病毒S蛋白A位点的重组猪痘病毒载体疫苗

权利要求书

1.一种重组猪痘病毒rSPV-SA，其特征在于：该重组猪痘病毒通过在猪痘病毒载体中插入猪传染性胃肠炎病毒S 蛋白A 位点的编码基因重组制备得到，A 位点编码基因序列如SEQ ID NO.1 所示，能够表达猪传染性胃肠炎病毒S蛋白A 位点。

2.权利要求1所述的重组猪痘病毒rSPV-SA，其特征在于：猪痘病毒载体为Kasza 株。

3.一种预防猪传染性胃肠炎的疫苗，其特征在于：该疫苗包括重组猪痘病毒rSPV-SA，其包括猪传染性胃肠炎病毒S 蛋白A 位点编码基因，该编码基因序列如SEQ ID NO.1 所示，能够表达猪传染性胃肠炎病毒S 蛋白A 位点即SA 蛋白。

4.权利要求1中 所述的猪传染性胃肠炎病毒S 蛋白A 位点的编码基因在制备治疗或预防猪传染性肠胃炎的药物上的应用。

5.权利要求1 或2所述的重组猪痘病毒rSPV-SA 在制备治疗或预防猪传染性肠胃炎的药物上的应用。

6.权利要求1 或2所述重组猪痘病毒rSPV-SA的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

(1) 引物设计：以S 蛋白A 位点编码基因为基础，设计引物序列，在引物5’端分别引入限制性内切酶BamH I 和Sal I 的酶切位点；

(2) 目的基因片段与载体连接：以猪传染性胃肠炎病毒JS2012 株的RNA 为模板，通过RT-PCR 反应，获得目的基因片段SA ；以BamH I 和Sal I 酶切目的基因片段和穿梭载体pUSZ11/P28M，凝胶电泳回收；在连接酶缓冲液中，连接酶切后目的基因片段和穿梭载体，获得含有目的基因片段SA 的穿梭载体pUSZ11/P28SA ；

(3) 重组猪痘病毒的获取：用脂质体转染法使穿梭载体pUSZ11/P28SA 与猪痘病毒Kasza 株发生同源重组，获得重组猪痘病毒rSPV-SA 原液；

(4) 通过细胞痘斑纯化重组猪痘病毒rSPV-SA。

7.权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述引物序列如下，SA1 ：5’-GCGTCGACATGGGTCTTGGTATGAAGCGTAG-3’；SA2 ：5-CGGGATCCTTATAGCGTCCTGTTAGTTTGTC-3’。

8.权利要求6 所述的制备方法，其特征在于，所述重组猪痘病毒的获取方法为：以猪痘病毒感染PK15 单层细胞，1h 后将脂质体与穿梭载体的混合液加入到PK15单层细胞，5-6h后换成细胞维持液，继续培养2-3 天；待细胞出现50％以上细胞病变后，将其反复冻融3次，收获重组猪痘病毒rSPV-SA 原液。