[发明专利]一种测定尿液中可替宁含量的方法

说明书

技术领域

本发明属于尿液代谢物检验技术领域，涉及一种尿液中可替宁的测定方法。

背景技术

烟碱，俗称尼古丁，是烟草的重要成分，占烟草中总生物碱的98％。烟碱是吸烟成瘾或烟草依赖的主要因素。进入人体内的尼古丁约80％在肝脏中的细胞色素酶P4502A6的作用下代谢为可替宁。可替宁随血液进入到人体各个部位，在血液、尿液、唾液等体液和肝脏及脑等器官中均发现可替宁的分布。可替宁在体内的半减期为18-22h，且由于尼古丁是可替宁的唯一来源，因此是目前公认的评价卷烟烟气暴露的特异性生物标志物。

由于尿液具有易采集，非创伤性等特点，是生物暴露风险评估中应用最为广泛的生物基质。尿液中可替宁的测定方法主要有：酶联免疫法、毛细管电泳化学发光法、气相色谱质谱法、液相色谱法和液相色谱-质谱法(LC-MS/MS)。LC-MS/MS具有灵敏度高，选择性强等特点，前期建立的LC-MS/MS法需要液液萃取或固相萃取净化尿液样本。Fan等建立了一个直接稀释过滤进样分析尿液中可替宁的LC-MS/MS方法，此方法简化了前处理过程，选取了一根常规的液相色谱柱(柱径：4.6mm，粒径：5μm)，但其分离的效果不如小粒径、窄内径的UPLC色谱柱。

发明内容

鉴于此，本发明目的在于提供一种操作简便、快速、准确、灵敏度高的尿液中可替宁含量的测定方法。

为解决以上技术问题，本发明提供的技术方案是，提供一种测定尿液中可替宁含量的方法，包括以下步骤：

步骤a)

移取尿液于离心管，加入氘代内标，用乙腈稀释；

步骤b)

将离心管置于涡旋振荡仪，涡旋振荡，静置；吸取上清液经有机相滤膜过滤，滤液待测；步骤c)

用甲醇配置可替宁标准储备液，低温避光保存；取一定量的储备液，用甲醇稀释定容，制得可替宁工作液；

用甲醇准确配置可替宁-d₃内标储备液，用内标储备液配制内标工作液，低温避光保存，使用前将其恢复到室温；

用乙腈配制不同浓度的可替宁标准工作溶液；

步骤d)超高效液相色谱-串联质谱测定

吸取配制好的不同浓度的可替宁标准工作溶液，注入UPLC-MS/MS系统，按内标法以峰面积计算出样品待测液中可替宁含量。

根据本发明的一个具体实施方式，步骤a)中，内标浓度为10μg/mL，加入尿液样品、内标、乙腈的体积依次为100μL，30μL和870μL。

根据本发明的一个具体实施方式，步骤b)中，涡旋振荡2min，2400转/min。

根据本发明的一个具体实施方式，步骤c)中，所述低温避光保存为：选用棕色玻璃瓶作为容器，放入-20℃保存。

根据本发明的一个具体实施方式，所述步骤d)中测定尿液中可替宁含量的具体操作为：吸取配制好的不同浓度的可替宁标准工作溶液，注入UPLC-MS/MS系统，绘制可替宁的线性回归方程，对纯化稀释后的样品待测液进行测定，测得分析物与内标峰面积的比值，代入一元线性回归方程，求得样品待测液中分析物的含量。

根据本发明的一个具体实施方式，所述UPLC-MS/MS系统的测定条件中：

色谱条件：选用色谱柱Atiantis UPLC BEH Shield RPC18，规格为50mm×2.1mm，1.7μm；流动相A：体积分数为0.1％的甲酸水溶液，流动相B：0.1％甲酸甲醇溶液；流速0.8mL/min，柱温35℃，进样量5μL；梯度洗脱；

根据本发明的一个优选实施方式，所述梯度洗脱条件：0～1min,98％A～98％A；1.1～3.0min,2％A～2％A；3.01～4.0min,98％A～98％A。

根据本发明的一个具体实施方式，所述UPLC-MS/MS系统的测定条件中：

质谱条件：电喷雾离子源，喷雾电压(IS)2.6kV；离子化温度350℃；雾化气流量1000L/Hr；锥孔气流量50L/Hr；碰撞气流量为0.15ml/min；碰撞气为氩气，其余气体为氮气；驻留时间为30msec，正离子MRM模式采集，选取m/z 177.2/98.0作为定量离子对，m/z 177.2/80.1为确认离子对，m/z 180.2/80.1为对应的氘代内标离子对。

根据本发明的一个具体实施方式，所述尿液为冷冻保存尿液，测定前在室温下解冻。

与现有技术相比，上述技术方案中的一个技术方案具有如下优点：