[发明专利]一种番茄植株顶芽内源激素含量的测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及农学中作物内源激素技术领域，具体涉及一种用于高效液相色谱法(HPLC)测定番茄植株顶芽内源激素含量的方法。

背景技术

番茄(Lycopersicon esculentum)是世界和中国主要设施作物之一，因其口味佳、营养丰富而深受广大消费者的喜爱。我国设施番茄栽培面积及产量均居世界首位。目前关于设施番茄的科学研究，多集中在形态指标、光合特性及干物质分配等方面。通过分子机理的研究，深入认识植物激素调控设施番茄生长、发育及其对环境适应的机制，具有重要的科学意义。

植物激素(plant hormone,PH)是指在植物体的某一部位合成，可转移到其他部位，并对植物的生长发育具有显著调节作用的微量有机物，亦称植物天然激素或内源激素。其特点是：(1)内源性：植物自身合成；(2)能从合成部位运往作用部位；(3)在极低浓度下发挥作用：参与细胞分裂与伸长、组织与器官分化、开花与结实、成熟与衰老、休眠与萌发等生理过程。生长素、赤霉素、细胞分裂素和脱落酸是植物体内四种重要的生长激素；植物内源激素种类多，含量甚微，且易被破坏。

目前关于番茄顶芽和叶片的内源激素测定方法有间接酶联免疫吸附法(ELISA)(生吉萍等，2000；乔志霞，2004；阮英，2005；朱延姝和冯辉，2005；贺忠群等，2010)，高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography，简称HPLC)是一种区别于经典液相色谱，基于仪器方法的高效能分离手段，因其高速、高效、高灵敏度、高自动化的特点，广泛用于各个领域，也是目前用于番茄内源激素测定的重要方法。目前关于利用高效液相色谱法测定番茄顶芽的内源激素的方法未见报道，本发明主要解决了在利用高效液相色谱法测定番茄顶芽激素时，探索番茄顶芽样品前处理方法、流动相的选择和色谱条件，对成功利用HPLC测定植物激素提供一种可靠快速方法。

已有番茄顶芽内源激素测定方法是间接酶联免疫吸附法(ELISA)，其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体(聚苯乙烯微量反应板)表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。但需要购买酶联免疫试剂盒，对试验条件高。高效液相色谱法测定快速、高效、高灵敏度、高自动化的特点，但对配制流动相、设置色谱条件要求较高，目前没有一种适合高效液相色谱法测定番茄顶芽内源激素的样品前处理、流动相、设置色谱条件的方法。

发明内容

发明目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种适合高效液相色谱法测定番茄顶芽内源激素含量的样品前处理、流动相及设置色谱条件的方法，具有测定快速、高效、高灵敏度、高自动化的特点。

技术方案：为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种番茄植株顶芽内源激素含量的测定方法，包括以下步骤：

1)供试番茄顶芽样品前处理；2)配制流动相、设置色谱条件；3)标准液的制备；4)专属性考察；5)线性关系考察；6)样品含量测定；

所述步骤1)的方法包括提取、石油醚萃取后进行减压蒸发，再调节pH，并经乙酸乙酯萃取后，最后经二次减压蒸发制成样品待测液；

所述步骤2)中流动相为甲醇与0.075％冰乙酸配制而成；

所述标准液和所述样品含量测定的植物激素包括IAA、ZT、ABA和GA₃。

进一步的，在本发明中，所述步骤1)的具体方法包括：

1-1)提取：供试番茄顶芽样品加入冷甲醇中，于4℃下静置16h浸提，抽滤得清液，得粗提取液；

1-2)石油醚萃取：将所述粗提取液用等体积石油醚萃取，弃去醚相，合并水相；

1-3)减压蒸发：将步骤1-2)所得的所述水相在37℃下旋转蒸发至所述水相体积的1/3～1/4，得一次浓缩液；

1-4)调节pH：将所述一次浓缩液调节pH至2.75～2.85之间；

1-5)乙酸乙酯萃取：将调节好pH的一次浓缩液用等体积乙酸乙酯萃取，弃去水相，合并酯相；

1-6)二次减压蒸发：将步骤1-5)所得的所述酯相在37℃下旋转蒸发至所述酯相体积的1/4～1/5，得二次浓缩液，用甲醇定容至所述二次浓缩液体积的2倍，制成样品待测液，保存于4℃下棕色瓶中，待测。

进一步的，在本发明中，所述步骤2)中所述流动相为：甲醇与0.075％冰乙酸按体积比为45：55配制流动相。

进一步的，在本发明中，所述步骤2)中，色谱条件设置为检测波长210nm，流速为0.7mL/min，进样量为20μL。