[发明专利]一种脂多糖诱导奶牛乳腺上皮细胞凋亡模型的建立方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种体外细胞凋亡模型的建立方法，尤其涉及一种脂多糖诱导奶牛乳腺上皮细胞凋亡模型的建立方法。

背景技术

乳腺炎常发生于奶牛和奶山羊等反刍动物，是由病原菌引起的乳腺的一种炎症反应，可导致严重的经济损失。目前，各国学者都试图探寻一种典型、廉价、易于建立的乳房炎动物模型，用以研究乳房炎的发病机理和寻求更好的防治药物。目前，国内外已有多篇报道关于向奶牛、奶山羊和小鼠等动物乳腺内灌注病原菌和内毒素等方法制作乳房炎动物模型，然而由于实验性奶牛和奶山羊乳房炎模型费用高，使其在临床实践中的广泛应用受到限制。因此，建立一种符合临床发病机制的体外乳腺炎模型对研究乳腺炎发病机理和防治更具有重要价值和实际意义。

乳腺是一个复杂的器官，由多种类型不同的细胞组成，这些细胞在乳腺的免疫生物学方面都发挥着各不相同的作用。最新研究结果表明乳腺上皮细胞在乳腺感染的过程中可能存在主动的应对反应，但对其机制还了解甚少，是目前国内外研究的热点。

脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)，是革兰氏阴性菌(G-)细胞外膜上一种大分子结构成分。牛的乳腺对LPS的刺激非常敏感，乳腺内灌注LPS，能够诱导出明显的乳房炎症状，同时可增加血液和乳汁中脂多糖结合蛋白和可溶性CD14的水平及炎性因子的释放，其诱发的炎症反应和G-菌感染引起的炎症反应有着极其相似的地方，因此在临床上有着极为广泛的应用。且已有研究报道表明，在体外经LPS刺激，乳腺上皮细胞亦能分泌炎症相关的介质来介导细胞损伤。

故本发明通过观察不同质量浓度的LPS对奶牛乳腺上皮细胞增殖活性、凋亡比例以及内部超微结构变化的作用，评估LPS诱导奶牛乳腺上皮细胞凋亡模型的建立方法，可为进一步研究乳腺上皮细胞凋亡信号调控奠定基础，为奶牛乳腺炎发病机理及防治研究提供试验模型。

发明内容

本发明提供了一种脂多糖诱导奶牛乳腺上皮细胞凋亡模型的建立方法，本发明所述脂多糖诱导奶牛乳腺上皮细胞凋亡模型的建立方法能够准确测定LPS诱导奶牛乳腺上皮细胞凋亡模型的诱导条件。

一种脂多糖诱导奶牛乳腺上皮细胞凋亡模型的建立方法，其中，包括如下步骤：

(1)培养奶牛乳腺上皮细胞，获取2-3代对数生长期细胞用于后续试验；

(2)取所述2-3代对数生长期奶牛乳腺上皮细胞，以1×10⁴个/孔的密度接种于72个96孔板，随机分为6个试验组，用CCK-8法检测所述6个试验组的细胞抑制率；所述6个试验组的设置条件为：向所述6个试验组96孔板每孔中分别加入含LPS的培养液100μL，6个试验组加入的所述培养液中LPS质量浓度分别为0、10、20、50、100和200μg/mL，所述6个试验组的作用时间段设置均分别包括3、8、16和24h；每组/每时间段3个复板；选取所述LPS质量浓度为0μg/mL的试验组为对照组，对所述各试验组各时间段得到的细胞抑制率进行统计学分析；找出所述细胞抑制率在40％～50％之间的所述试验组及其作用时间段。

经统计分析得出以下结果：所述细胞抑制率在40％～50％之间的所述试验组及其作用时间段为50μg/mL LPS作用于奶牛乳腺上皮细胞24h和100μg/mL LPS作用于奶牛乳腺上皮细胞8h。

(3)根据步骤(2)的结果，取所述2-3代对数生长期奶牛乳腺上皮细胞，以5×10⁵个/mL的密度每孔吸取2.5mL接种于6孔板，随机分成3个试验组，每组3个复孔；用流式细胞术检测所述3个试验组的细胞凋亡率；所述3个试验组的设置条件为：向所述3个试验组6孔板每孔中分别加入含LPS的培养液2.5mL，3个试验组加入的所述培养液中LPS质量浓度和作用时间分别为含0μg/mL质量浓度LPS的培养液作用24h、含50μg/mL质量浓度LPS的培养液作用24h、含100μg/mL质量浓度LPS的培养液作用8h。选取所述0μg/mL LPS作用细胞24h的处理组为对照组，并对所述各试验组细胞凋亡率进行统计学分析。找出所述细胞凋亡率在40％～50％之间的所述试验组。

经统计分析得出以下结果：所述细胞凋亡率在40％～50％之间的所述试验组为100μg/mLLPS作用于奶牛乳腺上皮细胞8h组。