[发明专利]一种核酸核糖体结合体系构建方法及应用

权利要求书

1.一种核酸核糖体结合体系构建方法，其特征在于所述的核酸核糖体结合体系构建方法是在经0.1%DEPC处理过的500μl的离心小管中于0~5℃加入12μl核糖体麦胚抽提溶液，再依次加入1ul RNAsin(40U/ul，Takara)，2ul含100 mM KAC, 4mM Mg(AC)₂, 20mM Hepes, 20mM DTT的溶液，1ul 1mM/each 20种氨基酸标准混合液（promega），2.5ul 10mM ATP, 1ul 10mM GTP,0.5ul 2mM 放线菌酮，1.5 ul 8mM磷酸肌酸, 1ug TMV-RNA, 0.5ul磷酸肌酸激酶，用DEPC处理水补至25μl，离心后置于23~26℃下14~16min，然后转置于0~5℃条件下得到核酸-核糖体结合体系。

2.根据权利要求1所述的核酸核糖体结合体系构建方法，其特征在于所述的核糖体麦胚抽提溶液是经麦胚的制备、核糖体麦胚抽提物的制备步骤制备得到，具体包括以下步骤：

A、麦胚的制备：取小麦种子，干燥至含水量12%，粉碎过孔径1mm筛，再过孔径0.45mm筛，收集0.45mm筛上的麦粉颗粒，加入麦粉颗粒固液体积比2~5倍的悬浮液，悬浮得到悬浮颗粒，去除溶剂后挑选完整麦胚，完整麦胚进一步洗涤，洗涤后加入固液体积比8~12倍的无菌水，置于摇床上于温度3~5℃晃摇洗涤8~12min，洗涤2~4次，加入固液体积比1~3倍的裂解液，超声处理，弃去裂解液，加入固液体积比8~12倍的DEPC处理水于摇床上震摇处理8~12min，处理2~4次，干燥，于3~5℃保存备用；

B、核糖体麦胚抽提物的制备：称取A步骤制备的麦胚0.05～0.15g，置于DEPC处理过的离心管中，加液氮，研磨成粉末，加入0.5～1.5ml的核糖体抽提缓冲液和8～12μl标准混合氨基酸，混摇使粉末分散，置于频率30Hz的振荡器上震荡抽提20～40s，于0～5℃静置2～4min，于3～5℃、转速30000r/min离心20～40min，上清液上Sephadex G-25柱，用1× Buffer A洗脱，以1.5ml/管或0.5ml/管依次收集洗脱液，并将洗脱液于3～5℃、转速30000r/min离心8～12min纯化处理，测定各管洗脱液260nm和280nm紫外吸收值，作洗脱曲线，以吸收峰作为不同组分的依据，对相应峰的洗脱液通过琼脂糖电泳和氯仿/酚法去蛋白后核酸琼脂电泳，鉴定洗脱液，确定含核糖体的麦胚抽提物并收集，得到目标物，置液氮中保存备用。

3.根据权利要求2所述的核酸核糖体结合体系构建方法，其特征在于A步骤中所述的悬浮液为环己烷-四氯化碳溶液，其体积配比为2：5。

4.根据权利要求2所述的核酸核糖体结合体系构建方法，，其特征在于A步骤中所述的裂解液为NP-40。

5.根据权利要求2所述的核酸核糖体结合体系构建方法，其特征在于B步骤中所述的核糖体抽提缓冲液为2×BufferA，配方具体为：40mM Hepes/KOH、120mM K(AC)₂ 、5mM Mg(AC)₂、2mM CaCl₂、4mM DTT。

6.一种权利要求1~5任一所述的核酸核糖体结合体系构建方法的应用，其特征在于所述的核酸核糖体结合体系构建方法用于研究药物筛选的应用。