[发明专利]一株在低磷环境下促进千年桐根系生长的内生真菌

说明书

技术领域

本发明涉及一株在低磷环境下促进千年桐根系生长的内生真菌。

背景技术

植物内生菌的研究始于19世纪末，Vogl从黑麦草Lolium temulentum L.种子中分离出第一株内生菌。但真正开始大量研究植株中的内生菌起始于上世纪八十年代，主要是在温带地区、亚热带地区和热带地区的植被中开展研究。

植物内生真菌的分布广、种类多，前人研究表明从绝大多数植物体内都能分离得到内生真菌，由此可见内生真菌普遍存在于植物体内。在全世界范围内至少在80多个属290多种的禾本科农作物中发现了内生菌。目前从植物中分离的内生菌根据其具有的独特功能可以分为：固氮菌、固钾菌、固磷菌等植物促生菌、具有抗病虫害的生防菌和具有促进植物对不良环境的修复能力的抗性菌。

目前，有关内生真菌对千年桐生长的影响研究还存在空白。

发明内容

本发明的目的在于提供一株在低磷环境下促进千年桐根系生长的内生真菌。

该真菌为青霉属（Penicillium sp.）ZG3，已于2015年1月30日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC No. 10467。

该菌的分离、纯化包括：

A、材料：将采集得到不同年份的根、枝茎、叶分成三个部分，用自来水清洗干净，分装到自封袋内，于4℃冰箱保存；

B、消毒：75%酒精漂洗30s→无菌水冲洗3-4次→15%的次氯酸钠漂洗（根7min，茎5min，叶3min）→无菌水冲洗4-5次。当样品最后一次浸洗后的水盛于灭菌的小烧杯中，在平板上划线作为对照，以检验样品的消毒是否彻底，若干天后如有菌落生成，则表明样品表面消毒不彻底，需继续调整消毒方法；

C、接种部位的选择：叶片：叶尖部、叶中部和叶基部3个处理；枝茎：上中下分为3部位，其中第3部位为枝茎交接处；根部：分为根尖和根基2个部分；

D 、接种：将消毒后的外植体用接种刀切开，铺放在培养基表面，于28℃恒温培养箱内培养5—7天后观察菌落生长状况。有的菌株繁殖迅速，可先将其产生的菌株进行分离纯化；生长缓慢且数量较少的菌株可延长观察时间，直到其生长稳定后纯化；

固体培养：使用改良马丁固体培养基，配方为蛋白胨 5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氢二钾1.0g/L、硫酸镁0.5g/L、琼脂14.0g/L、其它为无菌水，pH值6.4±0.2，培养温度为28℃，培养方式为平板培养；

E、将分离繁殖出的不同种类的内生真菌接入平板培养基进行纯化，经过2-3次点接纯化、转接后得到单一菌种的上述的Penicillium功能菌株。

上述的一种在低磷环境下促进千年桐根系生长的内生真菌应用菌液的制备方法，是将上述的菌株接入液体培养基，摇床振荡培养，培养温度为28℃，培养时间48～72h，利用血球计数板计算菌液浓度，将菌液用超纯水稀释成1.0-9.0×10⁶cfu/ml即为成品备用；液体培养基：为改良马丁培养基，其中蛋白胨 5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氢二钾1.0g/L、硫酸镁0.5g/L、其它为无菌水、pH值6.4±0.2。

上述的一种在低磷环境下促进千年桐根系生长的内生真菌应用菌液的应用方法，是应用该菌株的菌液浇施于千年桐苗木根际土壤或苗木直接接种。

上述的一种在低磷环境下促进千年桐根系生长的内生真菌应用菌液的应用方法，是用5.5×10⁶cfu/ml菌液，按每株100ml在林地浇于每株千年桐的根际。

本发明涉及的菌株是从千年桐植株中分离纯化得到的，经接种于千年桐土培苗，根据各项指标综合评判，进一步证实其对植株生长具有缓解低磷胁迫促进千年桐根系生长的作用，寻找到对促进植株生物量增长的有益的功能内生真菌可应用于生产。