[发明专利]一种提高甲醇营养型酵母表达系统表达量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物发酵领域，具体涉及一种能提高甲醇营养型酵母表达系统表达重组蛋白表达量的方法。

背景技术

酵母表达系统是目前应用最广泛的外源基因表达系统之一，而其中的甲醇营养型酵母营养要求低、生长快、培养基廉价，易于进行操作和培养；表达的外源蛋白可分泌到胞外，分泌的内源蛋白少，外源蛋白分离纯化简便，尤其是甲醇营养型酵母中的毕赤酵母已被广泛运用于生产中。

然而毕赤酵母在表达重组蛋白过程中，对于易降解类蛋白在发酵过程中容易被其自生酶系所降解，这对重组蛋白的表达积累非常不利。一般采取提高发酵过程氮源水平以降低菌体自身蛋白酶对重组蛋白的降解，此方法容易造成物料的浪费进而使发酵成本升高，且增加的氮源并不一定对重组蛋白的表达有较好的提升效果，同时发酵结束残余的氮源可能对后期提取纯化造成一定难度。也有在培养基中添加蛋白酶抑制剂来抑制重组蛋白的降解的方案，但效果并不显著，目前没有较好的方法大幅减少重组蛋白的降解，所以寻找抑制蛋白降解的方法显得十分重要。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术不足，开发一种提高甲醇营养型酵母表达系统表达重组蛋白表达量的方法。

为达到上述目的，本发明提供了一种提高甲醇营养型酵母表达系统表达量的方法：在甲醇营养型酵母发酵诱导阶段中，流加的甲醇中含有蛋白酶抑制剂。

在一些实施方案中，蛋白酶抑制剂为苯甲脒盐酸盐或苯甲基磺酰氟。

在另一些实施方案中，蛋白酶抑制剂为苯甲脒盐酸盐。

在一些实施方案中，蛋白酶抑制剂的含量为0.005mol/L～0.15mol/L。

在一些实施方案中，甲醇营养型酵母为巴斯德毕赤酵母。

在一些实施方案中，表达的重组蛋白选自羧肽酶B前体、胰岛素前体、胰岛素前体类似物、促胰高血糖素类前体或胰蛋白酶前体。

本发明使用的术语“前体”指通过一个或者多个随后的化学和/或酶促步骤可以得到目的蛋白的单链多肽。“胰岛素前体类似物”指A和/或B链相对于人胰岛素分子具有一个或多个突变、替代、删除、和/或添加的胰岛素前体分子。同理，如利用基因工程重组表达促胰高血糖素类、甘精胰岛素、门冬胰岛素、德谷胰岛素、赖脯胰岛素、胰蛋白酶、羧肽酶等，都是表达各自的单链多肽，也就是前体蛋白，这些属于本领域技术公知。

除非明确地说明与此相反，否则，本发明引用的所有范围包括端值。例如，“蛋白酶抑制剂的含量为0.005mol/L～0.15mol/L”表示蛋白酶抑制剂的含量n为0.005mol/L≤n≤0.15mol/L。

本发明的优势在于：1)添加蛋白酶抑制剂含量较少，成本低，也不影响后续分离提纯；2)随甲醇流加的方式向发酵体系导入蛋白酶抑制剂与发酵底物直接添加相比，对细胞生长影响更加温和，有利于进一步增加重组蛋白表达量。

具体实施方式

以下所述的是本发明的优选实施方式，本发明所保护的不限于以下优选实施方式。应当指出，对于本领域的技术人员来说在此发明创造构思的基础上，做出的若干变形和改进，都属于本发明的保护范围。

实施例中所用的原料均可以通过商业途径获得，所用的菌种构建方法属于本领域技术人员公知常识，本发明所用菌种宿主细胞和表达载体，参照Invitrogen的Multi-CopyPichiaExpressionKit和EasySelect^TMPichiaExpressionKit的试剂盒说明，属于技术公知。本发明所举实施例发酵方法，参照Invitrogen公司的PichiaFermentationProcessGuidelines中进行，其具体操作为：

发酵培养基由BSM，1％酵母提取物(YeastExtract)和PTM1组成。BSM和酵母提取物经121℃高温灭菌30min后，用50％氨水将pH调至5.0，再按4mL/L加入经无菌过滤的PTM1即得。

发酵分为三步：

第一步：发酵培养基培养约20h；

第二步：以10mL/h/L的速率流加含12mL/LPTM1的50％甘油，时间为6h。

第三步：以6mL/h/L的速率流加含12mL/LPTM1的甲醇进行诱导。为使诱导过程中的DO值不低于25％，需调节甲醇流加速率，诱导72h，菌液OD600达到500以上后结束培养。发酵培养过程中取发酵液，离心后取上清液HPLC检测蛋白含量。

实施例1

毕赤酵母GS115重组表达羧肽酶B前体