[发明专利]一种用于抗菌药物筛选的新载体

说明书

本发明公开了一种用于抗菌药物筛选的新载体，所述载体为pKD‑0011，主要用于筛选对铜绿假单胞菌的致病性和耐药性有明显抑制作用的抗菌药物。载体以耐药性及治病性双相关基因PA0011作为药物作用靶点，通过带有缺失启动子的报道基因luxCDABE的质粒pMS402，将耐药及致病双相关基因PA0011的启动子区域通过PCR扩增、酶切克隆到报道质粒pMS402荧光素酶操纵子基因前，构成启动子‑报道子融合载体pKD‑0011；利用电转化技术将重组质粒转入野生型的铜绿假单胞菌中，利用载体pKD‑0011的发光强弱可以筛选得到抑制PA0011表达的抗菌物质。该载体可以实现高通量筛选，利用相关筛选设备，操作简单，经济实用。

技术领域

本发明涉及一种用于抗菌药物筛选的载体，具体是一种用于筛选对铜绿假单胞菌的致病性和耐药性有明显抑制作用的抗菌药物的筛选载体。

背景技术

铜绿假单胞菌是一类机会致病菌，是引起医院内感染的主要原因，在免疫系统缺陷的的病人比如HIV病人、重度烧伤患者和肺囊肿纤维化病人中常常造成比较高的发病率和死亡率。

近年来，铜绿假单胞菌对几乎所有抗菌药物的耐受性都有所增加。一方面是由于不合理的使用抗生素，使得菌体产生了适应性耐药；另一方面是因为铜绿假单胞菌自身存在的较强的内在耐药机制发挥作用。铜绿假单胞菌对抗生素耐受性的不断增加使得临床上选用合适的治疗策略来治疗铜绿假单胞菌的感染变得十分困难，导致了越来越高的死亡率，因而发现新型的有效的抗菌物质迫在眉睫。

中药在防止慢性感染中己逐渐显示出独特的优势。我国具有丰富的中草药资源，来源广、价格低廉、毒副作用小、较少会出现耐药性且在细菌细胞内作用途径多样化，能产生多方面药理效应，因此可以作为潜在的抗铜绿假单胞菌的药物进行研究。

新的抗菌药物的筛选方法是发现新型抗菌物质的关键因素。传统的抗生素筛选方法缺点是作用靶点不明确、机制不清晰、不灵敏、筛选过程有随机性。基因标记方法是当前筛选方法中最先进的技术之一，通过标记特殊基因，寻找相关生物活性物，优点是灵敏、可检测低效物、可用于化学改进、易筛选、高通量。

抗生素除了传统意义上的抑菌和杀菌作用，还表现出其它活性，特别是在低于最小抑制浓度下，外界抗菌物质可以对基因的表达具有调节作用，可以调节致病因子的表达，诱导病原菌的抗药性，影响微生物群体中细胞间的相互作用等。利用抗生素的这一特性，可以通过构建特定基因的表达载体来筛选对该基因具有调节作用的新型抗菌物质。

类脂A是脂多糖(LPS)的重要结构之一，与LPS其他成分间相互作用形成外膜的有效屏障；当LPS结构装置缺损，LPS的结构就会被破坏，随之LPS层出现裂口，磷脂分子就会从外膜内层迁移到有裂口的地方，进行修补，即在外膜中形成了磷脂双分子层斑，导致外膜的屏障作用受损，从而可使疏水的抗生素和有害物质自由通透，细菌对抗生素或有害物质变得敏感。此外，类脂A还是LPS的内毒素组分，内毒素耐热而且稳定，是细菌的重要的致病物质。

铜绿假单胞菌中PA0011基因编码2-OH-酰基转移酶参与到类脂A的合成过程，团队通过前期研究发现：PA0011对于铜绿假单胞菌的生理生化功能、耐药性和致病能力都具有十分重要的作用，PA0011功能缺失后对四环素、庆大霉素、多粘菌素、利福平、羧苄青霉素、卡纳霉素，碳青霉烯类抗生素的抗性都明显降低，而且导致铜绿假单胞菌对HeLa细胞的侵染力降低，对果蝇的致死率也明显降低。而且，在其他菌株中也有类似的发现，例如，沙门氏菌中htrB为铜绿假单胞菌PA0011的同源基因，htrB的突变体内毒素活性降低，突变体致病性也受到影响。因此，PA0011可以作为一个很好的药物靶点，用于筛选新型抗菌物质。对于其它致病菌的用药治疗也有借鉴作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗菌药物筛选的载体，具体是以铜绿假单胞菌中的一个耐药基因为靶点，构建该基因的启动子-报道子的检测载体，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：