[发明专利]假禾谷镰刀菌LAMP的检测引物、反应体系及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种快速灵敏检测技术的建立，特别是涉及一种与假禾谷镰刀菌相关的恒等温扩增技术的建立，本发明还涉及该技术的优化。

背景技术

小麦土传真菌病害主要有纹枯病、全蚀病、根腐病及茎基腐病。在我国小麦产区普遍发生，并有逐年加重的趋势，严重威胁我国粮食生产安全。茎基腐病（crownrot）是由多种病原真菌引起的一种小麦病害，在澳大利亚、欧洲、北美、南非、北非及西亚等小麦生产区均有发生。茎基腐病破坏小麦茎基部，小麦根冠及茎基部产生坏死斑，造成苗枯、根腐、白穗等症状。在澳大利亚茎腐病是冬小麦生产中的一个主要病害，可造成小麦减产，有时可导致产量损失89%。澳大利亚学者认为引起小麦茎基腐病的主要病原为假禾谷镰刀菌（Fusariumpseudograminearum）。Smiley等对美国西北部太平洋沿岸小麦产区病原菌进行分类研究，认为其是由F.pseudograminearum、F.culmorum、F.avenaceum及F.acuminatum混合侵染的。在我国研究报道较少，陈厚德等认为小麦茎基腐病的病原菌是以镰孢菌为主，交链孢次之，而且镰孢菌致病力较强。李洪连等在中国首次报道了F.pseudograminearum引起小麦茎基腐病。

Aoki&O’Donnell通过形态学特征、生理学特征及基因序列差异证明禾谷镰刀菌（F.graminearum）群体1并非禾谷镰刀菌的一个类群，二者在孢子形态、基因序列等方面存在很大差异，故将此命名为假禾谷镰刀菌（Fusariumpseudograminearum），并设计其特异检测引物Fp1-1、Fp1-2，这也是假禾谷镰刀菌首次分子检测的报道。Akinsanmi等分别使用Fg16NF/R、Fp1-1和Fp1-2及其他引物对昆士兰和新南威尔士北部小麦病田F.graminearum、F.pseudograminearum等其他镰孢菌种类进行了鉴定和致病力分析；TigstDemeke等证实PCR检测与琼脂平板法和单端孢霉烯分析结果一致，可用于镰刀菌的种类鉴定；Ophel-Keller等采用TaqManReal-timePCR可对500g土壤中F.graminearum、F.culmorum、F.pseudograminearum及其他病原菌含量进行评估；Hogg等根据Tri5基因和β-actin基因（mjba-1）建立了相对定量PCR检测小麦上Fusarium侵染动态。

病害的准确诊断是病害防控的基础，目前诊断病原真菌的方法有形态学鉴定和分子生物学鉴定。利用形态特征进行分类鉴定是最直观、最常用的分类方法，但其耗时长，操作繁琐，且对于形态特征相似物种难以确定。近些年来，分子生物学技术的发展使得对病害的快速检测成为可能，同时分子生物学技术具有方法简单、检测快速、灵敏度高等优点，现已广泛应用于病原菌的分类、鉴定、病害的诊断及检测等方面。

以PCR为基础的分子鉴定方法在一定程度上克服了传统形态学鉴定的缺陷，但PCR检测需要专业、昂贵的仪器设备，并且需要专业的实验人员操作，检测仅限在实验室条件下进行，需要较长时间，限制了PCR检测方法在生产上的推广应用。

环介导恒等温扩增技术（loopmediatedisothermalamplification,LAMP）是一种在一般恒温条件下进行的扩增技术，所用设备简单、花费少，普通水浴锅或其他有稳定热源的装置就可以采用，不需要PCR仪和电泳仪等昂贵设备，同时它的检测灵敏度高，特异性强，结果肉眼课件，能够快速检测病原物。所以，建立假禾谷镰刀菌的LAMP检测体系有利于田间病害发生的快速检测。

发明内容

本发明的目的是建立LAMP检测假禾谷镰刀菌的快速检测方法。

一种假禾谷镰刀菌LAMP快速检测方法，所述检测引物的序列如下：

外引物FpF35'TCCCACAAATCATTCCCTGG3'

外引物FpB35'AACATACCAATGACGGTGACA3'

内引物FpFIP5'AGGAACCCTTACCGAGCTCGGGCGCATCATCACGTGTCA3'

内引物FpBIP5'CAAGCTCAAAGCCGAGCGTGAAGGAGTCTCGAACTTCCAGA3'。

利用权利要求1所述的假禾谷镰刀菌LAMP的检测引物进行LAMP反应的反应体系，25μl反应体系中：