[发明专利]河北白术PCR鉴定试剂盒及鉴定方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种DNA分子鉴定方法，特别涉及中药河北白术PCR鉴定试剂盒、特异性引物、模板及鉴定方法。

(二)背景技术

白术是为菊科植物白术Atractylodes macrocephala Koidz.的干燥根茎，具有健脾益气，燥湿利水，止汗，安胎等多种药用功能，在临床上应用较为广泛。白术品种较多，主要品种包括河北白术、浙白术、湖南平术、安徽徽术，分别产自河北、浙江、湖南和安徽。其中河北白术又名“小白术”，产量最高，且药用成分与其他品种有些差异。由于近年来河北白术种植基地不断的扩大，种质资源混乱以及以次充好现象较为严重，对白术品种做出准确的鉴定有利于白术的扩种和中药质量监管。

现今对不同产地白术的鉴定方法主要包括外观鉴定，利用化学试剂、光谱、核磁共振等技术进行理化性质鉴定，但由于不同产地白术的亲缘关系较近，致使形态和理化性质较相似，利用传统中药鉴定方法较难鉴定。随着生物学技术的发展，应用分子生物学手段，利用中药基因序列的差异性对中药进行分子鉴定，具有准确、简便、重复性好、耗时短等诸多等优点。

性好的诸多优点，鉴定的结果不受样品产地、生长环境和来源的影响。本发明提供的PCR检测法就是一种河北白术的DNA分子鉴定方法，能够准确鉴定河北白术。目前文献报道的对河北白术做出准确鉴定的方法均为传统的中药鉴定手段，利用PCR检测法对河北白术进行鉴定尚未见报道。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种能够准确鉴定中药河北白术的PCR鉴定试剂盒和检测方法，包括PCR检测法关键试剂PCR引物、模板和PCR检测法的检测步骤。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种河北白术PCR鉴定试剂盒，所述试剂盒中的特异性引物为HBZ1(SEQ ID NO.2)和HBZ2(SEQ ID NO.3)：

HBZ1：5’-GGACATGACAGAAGTATG-3’，

HBZ2：5’-TGCTGAGAGAAGCAAATC-3’。

进一步，所述的河北白术PCR鉴定试剂盒的组成为：

本发明还涉及一种利用所述河北白术PCR鉴定试剂盒对河北白术进行鉴定的方法，所述方法为：

(1)模板DNA的提取和质量鉴定：采用常规提取法提取供试品DNA作为PCR的模板；以电泳法检测模板DNA的质量(检测方法同步骤(3))，条带清晰无弥散的，即为符合PCR反应的模板DNA；

(2)PCR鉴定：利用河北白术PCR鉴定试剂盒中的特异性引物HBZ2和HBZ3，进行PCR扩增：

PCR反应溶液：

将PCR反应溶液放入PCR自动扩增仪器中进行PCR扩增反应，反应程序设置为：94℃预变性3min，94℃变性45s，60-65℃复性45s，72℃延伸1min，35个循环，最后72℃延伸7min；

(3)PCR产物进行电泳检测：取出PCR扩增产物(即扩增反应后的反应液)5μL与加样缓冲液1μL混合，用1.2％琼脂糖凝胶电泳(含0.5％溴化乙锭)检测扩增结果，在778bp处出现扩增条带的为河北白术，在778bp处不出现扩增条带的不是河北白术。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：(1)本发明根据凝胶电泳在778bp处有无扩增条带作为鉴定河北白术的依据，可以检测单个或者混合白术DNA样品，检测准确、灵敏度高、操作简单、耗时短、重复性好；(2)利用河北白术PCR鉴定试剂盒中引物HBZ1和HBZ2以及PCR反应溶液配方可以制造河北白术鉴定试剂盒；(3)本发明提供了一种快速、准确鉴定河北白术的方法，可以广泛应用于河北白术中药选种育种、种植、采收储存、销售、临床应用各环节的品种鉴定，在鉴别中药真伪，打击伪品，加强中药质量监管，促进中药现代化发展方面具有重大意义。

(四)附图说明

图1为十四种供试品经PCR检测法鉴定后的电泳图，泳道1～14分别为河北白术、浙白术、湖南平术、安徽徽术、苍术、关苍术、杭白菊、野菊、蒲公英、向日葵、黄精、浙贝母、杭麦冬、益母草，泳道M为marker。

图2为不同浓度的河北白术经PCR检测法鉴定后的电泳图，泳道M为Marker，泳道1为0.08ng/μL，泳道2为0.8/μL，泳道3为8ng/μL。