[发明专利]一种腺病毒实时荧光定量PCR试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域中的PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链反应)试剂盒，尤其涉及一种腺病毒实时荧光定量PCR试剂盒。

背景技术

    腺病毒（Adenovirus，ADV）是导致免疫抑制个体发病率和死亡率的主要诱因。腺病毒是一种无外壳的双链DNA病毒，腺病毒对呼吸道、胃肠道、尿道和膀胱、眼、肝脏等均可感染，人腺病毒约1/3的已知血清型通常与人类疾病相关，但一种血清型可引起不同的临床疾患；相反，不同血清型也可引起同一种疾患。此前病毒分离与鉴定的方法主要为：病毒的分离培养，标本应尽早从感染部位采集。采集患者咽喉、眼分泌物，粪便和尿液等，加抗生素处理过夜，离心取上清接种敏感细胞（293、Hep-2或HeLa细胞等），37℃孵育后可观察到典型CPE，即细胞变圆、团聚、有拉丝现象，最突出的表现是许多病变细胞聚在一起呈葡萄串状。病毒抗原抗体鉴定，用荧光标记的抗六邻体抗体与分离培养细胞作用来鉴定腺病毒，也可用血凝抑制（hemoagglutination inhibition，HI）试验或中和试验（neutralization test，NT）检测属和组特异性抗原并鉴定病毒的血清型。

上述所述检测病毒的方法在一定程度上是有效的，但是它们也有不足的地方，如病毒的分离培养，是需要耗费大量人力、物力和时间的，抗体检测对一些临床样本缺乏足够的灵敏度，有时不能判定出一些正常个体中的潜伏感染。一种更有效快速准确的检测技术，实时荧光定量PCR技术对ADV进行检测，取病变组织或细胞，提取病毒DNA，与标记的病毒DNA探针和引物进行杂交来判断是否被感染。这种方法的优点体现在高灵敏度、高准确性和高速率，在应对病毒大爆发流行时能为医院等单位在面临大堆的临床样本时提供更加快速精确的检测，及时对疫情的加以控制和对流行病学调查作出巨大的贡献。

发明内容

本发明的目的就在于克服现有技术存在的缺点和不足，提供一种腺病毒实时荧光定量PCR试剂盒。

本发明的目的是这样实现的：

1、腺病毒实时荧光定量PCR试剂盒（简称试剂盒）

本试剂盒是在对腺病毒核酸序列分析的基础上，选取保守基因序列设计出一对特异性引物和一条特异性的荧光探针，利用实时荧光定量PCR技术对腺病毒进行检测。此技术不仅缩短了操作时间，减少了污染，也降低了样品诊断的成本，具有潜在的应用价值。

在按下述方法设计的引物和探针存在下，在荧光定量PCR仪中，对病毒核酸进行PCR扩增，来实现对腺病毒的检测。

具体地说，本试剂盒包括腺病毒的一对特异性引物（F和R）、一条特异性荧光探针（FP）、阳性对照、阴性对照、5×PCR Buffer和Enzyme Mix；

①特异性引物

F：5'-AGCCACGGTGGGGTTTCTAAACTTT-3'     25bp,

R：5'-GGCCCCAGTGGTCTTACATGCACATCC-3'   27bp；

②荧光探针

FP：Cy5-ATGCACCAGACCCGGGCTCAGGTACTCCGA-BHQ-2     30bp，

荧光探针5’端标记荧光报告基团Cy5，3’端标记荧光淬灭基团BHQ-2；

③阳性对照

腺病毒标准品；

④阴性对照

RNase Free H₂O；

⑤5×PCR Buffer配制

       Tris·Cl          20mM

       KCl               80mM

（NH₄）₂SO₄                   80mM

   DTT                1.5mM

   MgCl₂             12mM

   dNTP              10mM

   配置混合后于冰箱-20℃保存；

⑥Enzyme Mix配制

        Tris·Cl           20mM

        KCl                80mM

    DTT                 1mM