[发明专利]一种单纯疱疹病毒实时荧光定量PCR试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域中的PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链反应)试剂盒，尤其涉及一种单纯疱疹病毒实时荧光定量PCR试剂盒。

背景技术

单纯疱疹病毒（herpes simplex virus，HSV）是属于疱疹病毒科a病毒亚科的线性双链DNA病毒。HSV能引起人类多种疾病，如龈口炎（gingivostomatitis）、角膜结膜炎（keratoconjunctivitis）、脑炎（encephalitis）以及生殖系统感染和新生儿的感染。在感染宿主后，常在神经细胞中建立潜伏感染，激活后又会出现无症状的排毒，在人群中维持传播链，周而复始地循环。根据抗原性的差别目前把该病毒分为1型和2型。1型主要由口唇病灶获得，2型可从生殖器病灶分离到。人群被病毒感染发生后四个月到数年被感染的人数可达人口总数的50—90%，是最易侵犯人的一种病毒，但在临床仅有一部份发病。此病可分为口唇性疱疹、疱疹性角膜炎、疱疹性皮肤炎、阴部疱疹和卡波西病等。

当前，病毒的分离培养是当今临床上诊断疱疹病毒感染的可靠依据。可采集皮肤、脑脊液、角膜刮取物、唾液等标本，接种人二倍体成纤维细胞株WI38及其它传代细胞株如Vero、BHK等，经24～48小时后，细胞则出现肿胀、变圆、细胞融合等病变。然后用HSV-1和HSV-2的单克隆抗体作免疫荧光染色鉴定或应用DNA限制性内切酶图谱分析来定型。常用于抗体检测的方法有补体结合试验、中和试验、免疫荧光及酶联免疫吸附试验等，临床多用于急性感染诊断和器官移植患者的检测，以及流行性病学调查。如用于急性感染诊断，应采取急性期和恢复期双份血清，同时检测血清中的IgG和IgM。上述两种方法对HSV的检测在一定程度上是有效的；但是它们也有不足的地方：如病毒的分离培养，是需要耗费大量的人力、物力和时间；抗原抗体检测对一些临床样本缺乏足够的灵敏度，有时不能判定出一些正常个体中HSV的潜伏感染。

发明内容

本发明的目的就在于克服现有技术存在的缺点和不足，提供一种单纯疱疹病毒实时荧光定量PCR试剂盒。

本发明的目的是这样实现的：

1、单纯疱疹病毒实时荧光定量PCR试剂盒（简称试剂盒）

本试剂盒是在对单纯疱疹病毒核酸序列分析的基础上，选取保守基因序列设计出一对特异性引物和一条特异性的荧光探针，利用实时荧光定量PCR技术对单纯疱疹病毒进行检测。此技术不仅缩短了操作时间，减少了污染，也降低了样品诊断的成本，具有潜在的应用价值。

在按下述方法设计的引物和探针存在下，在荧光定量PCR仪中，对病毒核酸进行PCR扩增，来实现对单纯疱疹病毒的检测。

具体地说，本试剂盒包括单纯疱疹病毒的一对特异性引物（F和R）、一条特异性荧光探针（FP）、阳性对照、阴性对照、5×PCR Buffer和Enzyme Mix；

①单纯疱疹病毒的一对特异性引物（F和R）

F：5'-ACTCGAGTGCGAAAAGACGTTCT-3'  23bp

R：5'-GTATCGTCGTAAAACAGCAGGTC-3'  23bp；

②单纯疱疹病毒的一条特异性荧光探针（FP）

FP：FAM-AAAGGGCGTGGATCTGGTGCGT-MGB-1 22bp，

荧光探针5’端标记荧光报告基团FAM，3’端标记荧光淬灭基团MGB；

③阳性对照

单纯疱疹病毒标准品；

④阴性对照

RNase Free H₂O；

⑤5×PCR Buffer配制：

       Tris·Cl        20mM

       KCl             80mM

（NH₄）₂SO₄               80mM

   DTT              1.5mM

   MgCl₂           12mM

   dNTP            10mM ，

   配置混合后于冰箱-20℃保存；

⑥Enzyme Mix配制：

        Tris·Cl           20mM

        KCl                80mM