[发明专利]采用膜过滤法从中国林蛙皮中分离提取透明质酸的方法

权利要求书

1.采用膜过滤法从中国林蛙皮中分离提取透明质酸的方法，其特征是：包括以下步骤

步骤一、选取取油后在-2℃或者-2℃以下冷冻保存的中国林蛙皮1000克，放入玻璃容器中，加中国林蛙皮10倍量的水浸泡20小时～28小时；

步骤二、将步骤一浸泡后的中国林蛙皮及其溶液全部注入高速组织捣碎机，以10000转/分钟～14000转/分钟的转速匀浆2分钟～3分钟，匀浆后成糊状；

步骤三、将步骤二得到的糊状物全部注入恒温磁力搅拌器中，搅拌加热至85℃～95℃后，保温5分钟～15分钟，冷却至45℃～55℃并保温、自溶12小时；

步骤四、将步骤三得到的糊状物全部注入离心机中，以4000转/分钟离心，得到离心后的溶液和离心后的残渣；

步骤五、分别取离心后的残渣2倍量的水，洗涤离心后的残渣两次，将洗涤后的溶液与离心后的溶液混合；

步骤六、取HCl滴入步骤五得到的溶液中，调PH值至1.7～3.3，用500nm孔径的陶瓷膜过滤，得到过滤后的溶液和过滤后的残渣；

步骤七、分别取过滤后的残渣3倍量的水，洗涤过滤后的残渣3次，并将洗涤后的水与过滤后的溶液混合，得到截留液；

步骤八、取NaOH溶液滴入步骤七得到的截留液中，调PH值至7.5～8.5，取每克含活性蛋白酶40mg～50mg的胃蛋白酶，40克～50克加入到碱性的截留液，保持温度45℃～50℃，酶解小时8小时～12小时，得到酶解液；

步骤九、将步骤八得到的酶解液全部注入离心机中，以3600转/分钟离心，取上清液；

步骤十、取HCl滴入步骤九得到的上清液中，调PH值至1.7～3.3，用500nm孔径的陶瓷膜过滤，得到过滤后的溶液和过滤后的残渣；

步骤十一、分别取过滤后的残渣3倍量的水，洗涤过滤后的残渣10次，并将洗涤后的水与过滤后的溶液混合；

步骤十二、将步骤十一得到的溶液，加入NaCl，使溶液中NaCl的浓度为0.1mol/L～1mol/L，滴入HCl调PH值至6.5，加入本溶液体积3倍的95％乙醇进行洗脱，静置24小时，以3600转/分钟离心，于真空干燥箱中60℃干燥24小时，得到透明质酸HA粗品；

步骤十三、按照HA粗品与水的比例1：30向将步骤十二得到的HA粗品中加水，同时加入溶液体积3％的高岭土，50℃加热30分钟，进行脱色，以3600转/分钟离心，得到离心后的溶液和离心后的残渣；

步骤十四、按照离心后的残渣与水的比例1：1，加水洗涤步骤十三得到的离心后的残渣，将洗涤后的水以3600转/分钟离心，将离心后的水溶液与步骤十三得到的离心后的溶液混合，放置冷却至0℃～4℃，加入三氯醋酸饱和溶液，使溶液中三氯醋酸浓度达到8％，静置半小时后，以3600转/分钟离心，取上清液；

步骤十五、将步骤十四得到的上清液，加入NaCl，使溶液中NaCl的浓度为0.1mol/L～1mol/L，加入本溶液体积3倍的95％乙醇进行洗脱，静置24小时，用布氏漏斗抽滤，得到的滤液依次用95％乙醇、无水乙醇各洗涤一次进行醇沉，得到透明质酸HA精品。

2.根据权利要求1所述的采用膜过滤法从中国林蛙皮中分离提取透明质酸的方法，其特征是：所述步骤一、步骤五、步骤七、步骤十一和步骤十四中使用的水均为无菌蒸馏水。