[发明专利]一种灭线虫天然植物生物复合营养液及制备方法

权利要求书

1.一种灭线虫天然植物生物复合营养液，其特征在于：包括按重量配比的枯草芽孢杆菌（菌种孢子含量为1.0×10¹⁰个/g）1份、淡紫拟青霉菌（菌种孢子含量为2.0×10⁹个/g）3份、白僵菌（菌种孢子含量为1.2×10¹¹个/g）1份和植物万寿菊花提取液100份、百部提取液300份、孔雀草提取液100份、苦参提取液100份、鱼藤提取液100份、苦楝提取液200份以及蛋白液100份。

2.一种灭线虫天然植物生物复合营养液的制备方法，其特征在于：灭线虫天然植物生物复合营养液包括按重量配比的枯草芽孢杆菌（菌种孢子含量为1.0×10¹⁰个/g）1份、淡紫拟青霉菌（菌种孢子含量为2.0×10⁹个/g）3份、白僵菌（菌种孢子含量为1.2×10¹¹个/g）1份和植物万寿菊花提取液100份、百部提取液300份、孔雀草提取液100份、苦参提取液100份、鱼藤提取液100份、苦楝提取液200份以及蛋白液100份；其制备方法如下：

（1）以现有技术常规方法制备淡紫拟青霉菌（菌种孢子含量为2.0×10⁹个/g）、白僵菌（菌种孢子含量为1.2×10¹¹个/g）、枯草芽孢杆菌（菌种孢子含量为1.0×10¹⁰个/g）；

（2）植物提取液的制备方法：

首先制备万寿菊花、百部根、孔雀草茎叶、苦参根、鱼藤茎叶、苦楝种子的各单种植物提取液，将百部取根切薄片、孔雀草取茎叶破碎、苦参取根切薄片、鱼藤取茎叶破碎、苦楝取种子破碎，按重量配比取单种植物原料1份，放入容器，导入同体积的90%乙醇，浸泡48h；取出浸泡的材料进行压榨，压榨后的汁液进行过滤，去渣，所得液体自然挥发浓缩48h，得第一次汁液；将提取后的残渣加入三倍于愿体积的含10％乙醇和含1%醋酸的水溶液浸泡48h，进行二次压榨，所得汁液过滤去杂，加入到第一次汁液，得混合液体；将混合液体加热收集乙醇，至液体的体积降为原混合液体的1／2时，停止加热，凉至常温，加入小苏打将PH值调至到5-5.5，得单种植物提取液；

按重量配比取上述制备的万寿菊花提取液1份、百部提取液3份、孔雀草提取液1份、苦参提取液1份、鱼藤提取液1份、苦楝提取液2份混合得植物提取液；根据重量配比放大制备植物提取液900份；

（3）蛋白液的制备方法：按重量配比取蛋白胨粉10份，加水90份搅拌溶解，制得100份蛋白液；

（4）取制备的淡紫拟青霉菌3份，在无菌操作环境下打开，以吸管吸加适量植物提取液，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散，然后加入植物提取液300份，置35℃培养18h～24h；用接种环取培养的菌悬液，划线接种于营养玉米糊培养基平板上，于35℃培养18h～24h；用接种环分别取菌样少许涂于玻片上，固定后以改良芽孢染色法染色，并在显微镜（油镜）下进行镜检；当孢子形成率达95% 以上时即可，否则，应继续在室温下放置一段时间，直至达到上述孢子形成率达95% 以上得含淡紫拟青霉菌的菌悬液；

（5）取制备的白僵菌1份，在无菌操作环境下打开，以吸管吸加适量植物提取液，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散，然后加入植物提取液300份；置35℃培养18h～24h；用接种环取培养的菌悬液，划线接种于牛肉浸膏培养基平板上，于35℃培养18h～24h；用接种环分别取菌样少许涂于玻片上，固定后以改良芽孢染色法染色，并在显微镜（油镜）下进行镜检；当两种孢子形成率达90% 以上时即可，否则，应继续在室温下放置一段时间，直至达到上述孢子形成率达90% 以上得含白僵菌的菌悬液；

（6）取制备的枯草芽孢杆菌1份，在无菌操作环境下打开，以吸管吸加适量植物提取液，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散，然后加入植物提取液300份，置35℃培养18h～24h；用接种环取培养的菌悬液，划线接种于营养琼脂培养基平板上，于35℃培养18h～24h；用接种环分别取菌样少许涂于玻片上，固定后以改良芽孢染色法染色，并在显微镜（油镜）下进行镜检；当三种孢子形成率达80% 以上时即可，否则，应继续在室温下放置一段时间，直至达到上述芽孢形成率达80% 以上得含枯草芽孢杆菌的菌悬液；

（7）将上述制备的3种菌悬液混合，用搅拌机打碎菌块，使成均匀的菌悬液；或者将菌悬液加热至45℃24h，使菌块分散；

（8）用200目无菌纱布过滤菌悬液，清除其中的凝块和不溶物；

（9）将过滤后的菌悬液，置无菌离心机内，以3000 r/min 速度离心；取清液，吹吸使菌体重新悬浮；再离心和重新悬浮清洗，先后共3遍；

（10）在洗净的菌悬液中加入蛋白液100份，加入小苏打将PH值调至到5-5.5；

（11）将菌液加温至70℃20min，以杀灭残余的繁殖活体，冷至室温，得灭线虫天然植物生物复合营养液。