[发明专利]一种氨氧化古菌实时荧光定量PCR的引物及检测方法

权利要求书

1.一种氨氧化古菌实时荧光定量PCR的引物，其特征在于，引物的序列如下：

正向引物AOA_amoA_F：5'-TTCTACACAGACTGGGCGTG-3'；

反向引物AOA_amoA_R：5'-GTTAGGTCCAAAAGCATCGC-3'。

2.一种氨氧化古菌的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，引物的合成：

引物的序列为：

正向引物AOA_amoA_F：5'-TTCTACACAGACTGGGCGTG-3'；

反向引物AOA_amoA_R：5'-GTTAGGTCCAAAAGCATCGC-3'；

将所述引物用管子分装，并在管子上标上分装的日期及所述引物名称，作为引物原液，放于-20℃冰箱保存，所述引物使用之前需用无菌水进行10倍稀释；

步骤2，普通PCR、克隆与测序来鉴定引物的特异性：

选择不同类型环境样品，使用DNA提取试剂盒，提取DNA，并用微量紫外分光光度计测定DNA浓度，将提取的样品的DNA进行不同倍数稀释，作为DNA模板进行PCR；

步骤3，标准品质粒的制备；

步骤4，实时荧光定量PCR反应体系和反应程序的建立；

步骤5，标准曲线的绘制：

将步骤3中制备的所述标准品质粒，进行10倍梯度稀释，共做8个稀释度：10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹，将这8个稀释度作为标准品质粒模板，配置定量PCR体系并进行扩增，每个模板3个平行，以质粒拷贝数和相应的阈值循环数Ct作图，并进行线性拟合，得到标准曲线；

步骤6，实时荧光定量PCR检测方法的评价。

3.根据权利要求2所述的一种氨氧化古菌的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，步骤2包括：

步骤21，普通PCR25μl的反应体系：

12.5μl PCR混合溶液，0.5μl正向引物和0.5μl反向引物，9.5μl灭菌水，2μl DNA模板，共25μl PCR体系，将配置好的八连管放于PCR仪；

步骤22，PCR扩增反应：

95℃预变性2min；95℃变性45s、54℃退火1min、72℃延伸1min，扩增36个循环；72℃延伸10min，保持4℃直至取出样品；取18μl PCR产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，对目的条带进行切割，并用凝胶回收试剂盒回收目的基因片段；

步骤23，克隆与测序：

步骤231，使用克隆试剂盒将步骤22中获得的目的基因片段连接到载体，采用热击法进行转化，把重组之后的质粒转入感受态细胞中并涂布到平板上，37℃过夜培养，构建克隆文库；

步骤232，随机挑取大小中等的克隆菌至10μl无菌水中，轻轻吹吸使其充分混合，作为阳性验证所用的菌液，并用试剂盒提供的载体引物M13F/M13R作为鉴定重组子的引物；

其中20μl阳性克隆的体系为：6.4μl灭菌水，0.8μl上引物，0.8μl下引物，10μl混合溶液，2μl菌液；

步骤233，PCR程序如下：94℃，2min；94℃、30s，56℃、30s，72℃、20s，扩增30个循环；72℃，10min；PCR产物取出后，加入4μl上样缓冲液，离心混匀，取18μl PCR产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测；

步骤234，验证为阳性的克隆子，并将剩余的8μl菌液进行测序。

4.根据权利要求2所述的一种氨氧化古菌的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，步骤3包括：

步骤31，提取阳性克隆子对应的质粒；

步骤32，将提取后的质粒溶液用微量紫外分光光度计测定其DNA浓度，根据相对分子质量和阿伏伽德罗常数计算出质粒的基因拷贝数；

基因拷贝数(拷贝数/μl)＝6.02*10²³*质粒浓度(ng/μl)/质粒相对分子质量/10⁹/660；

其中，质粒相对分子质量为质粒本身长度与插入目的片段长度之和。