[发明专利]肿瘤循环DNA KRAS突变检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及肿瘤循环DNA KRAS突变检测方法。

背景技术

基于外周血循环DNA的高通量测序的突变检测特异性强、灵敏度高。通过外周血循环DNA KRAS的突变检测，可以避免过度治疗及其带来的潜在副作用的影响，而其他患者可进行更为积极的治疗。进一步可以构建动力进化数学模型来确定个人化的癌症最佳治疗方案。

K-ras是一种原癌基因，长约35kb，位于12号染色体，是RAS基因家族成员之一，编码K-ras蛋白，与肿瘤的生成、增殖、迁移、扩散以及血管生成均有关系。K-ras基因(K-ras，p21)家族与人类肿瘤相关的基因有三种——H-ras、K-ras和N-ras，分别定位在11、12和1号染色体上。K-ras基因因编码21kD的ras蛋白又名p21基因。在ras基因中，KRAS对人类癌症影响最大，它好像分子开关：当正常时能控制调控细胞生长的路径；发生异常时，则导致细胞持续生长，并阻止细胞自我毁灭。它参与细胞内的信号传递，当KRAS基因突变时，该基因永久活化，不能产生正常的ras蛋白，使细胞内信号传导紊乱，细胞增殖失控而癌变。研究表明约30％的人类恶性肿瘤与RAS基因突变有关，ras突变后的产物可以一直处于活化状态。在白血病、肺癌、直肠癌和胰腺癌中，KRAS突变均很常见，其中直肠癌中30％-35％患者有突变。其与肿瘤细胞的生存、增殖、迁移、扩散和血管生成均有关系。KRAS基因分为突变型和野生型，常见突变位点为KRAS基因2号外显子的12号密码子和13号密码子上，其中有7个突变热点：G12C(GGT>TGT)、G12R(GGT>AGT)、G12S(GGT>CGT)、G12V(GGT>GTT)、G12D(GGT>GAT)、G12A(GGT>GCT)、G13D(GGC>GAC)。这7种突变占到了90％以上。

检测KRAS基因突变是深入了解癌基因的情况、了解各种癌症的发展预后、放化疗疗效的重要指标。2009年7月20日，美国食品药品监督管理局(FDA)公布了对表皮生长因子受体(EGFR)靶向药物使用说明书的修改版本，其中明确阐述了用于相关癌症治疗的EGFR受体抑制剂药效与KRAS基因密切相关性，并要求使用该类药物前进行KRAS基因突变检测以帮助医生判断适用人群。FDA此次更新了Amgen公司生产的维克替比(Vectibix，帕尼单抗Panitumumab)和ImClone公司生产的爱必妥(Erbitux，西妥昔单抗Cetuximab)药品说明书中“使用指南”和“临床研究”部分。注明如果患者肿瘤细胞中KRAS基因的12或13密码子发生突变，那么该患者就不会从EGFR抑制剂类药物的治疗中获益，所以不推荐发生KRAS基因突变的患者使用此类药物。同时，中华人民共和国卫生部于2010年10月14日发表了《结直肠癌诊疗规范(2010版)》(卫办医政发(2010)165号)。规范指出，在人群中进行早期疾病用药基因筛查诊疗对于预防结直肠癌发生、防止向晚期发展、治疗以及降低结直肠癌死亡率有重要作用。该规范明确指出在患者确定为复发或转移性结直肠癌接受爱必妥、帕尼单抗时,必须检测肿瘤组织的K-ras基因状态。现在在欧美等发达国家，K-RAS基因检测已经成为大肠癌患者治疗前必做的常规检查，是目前医生了解大肠癌患者癌基因状况最直接、最有效的方法，并且成为能否报销相关抗EGFR治疗费用的依据。

针对患者组织标本进行一代测序，基于该结果进行用药指导是目前通用方案。但是在实际临床治疗过程中，观察到对KRAS基因野生型的患者采用西妥昔单抗治疗一段时间后出现耐药性。这种耐药性是如何产生的呢？现有研究表明癌症可能源于体细胞突变，癌症基因在突变体细胞内不断累积，后者也逐渐完成了自身的进化。有研究者认为单一细胞的基因组学研究是癌症进化研究的重点，其可以破解癌症突变的顺序及时间，为人们理解癌症突变、耐药的机制提供很好的思路。但我们认为单细胞测序不能帮助我们了解和解析个体患者的独特特征所构成的复杂体系。常规测序分型的鉴定方式无法达到高灵敏度检测到混杂样品中突变位点发生的低比例突变，更加无法达到精确定量，而在放化疗的“自然压力”下，这种“适应性情况”中，某些极低突变随着肿瘤进展而暂时增加，而正是这种“趋同进化”导致了耐药性的产生。有研究者认为应该通过动力进化数学模型来确定个人化的癌症最佳治疗方案。医生不可能针对同一患者多次取得组织样本，因此通过外周血进行无创或微创成为必然的选择。而本发明将为此提供有效指导方案。

发明内容