[发明专利]一种亮氨酸脱氢酶及其制备方法和应用有效

专利信息
申请号: 201510187159.3 申请日: 2015-04-20
公开(公告)号: CN104774813B 公开(公告)日: 2019-02-26
发明(设计)人: 贾红华;韦萍;朱文骏 申请(专利权)人: 南京工业大学
主分类号: C12N9/06 分类号: C12N9/06;C12N15/53;C12N15/70;C12N1/21;C12P13/04
代理公司: 南京经纬专利商标代理有限公司 32200 代理人: 王月霞
地址: 211816 江*** 国省代码: 江苏;32
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摘要:
搜索关键词: 一种 亮氨酸 脱氢酶 及其 制备 方法 应用
【权利要求书】:

1.一种亮氨酸脱氢酶,其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.编码权利要求1所述亮氨酸脱氢酶的基因,其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种表达载体,它包含权利要求2所述的亮氨酸脱氢酶的基因。

4.一种重组菌,其是通过利用权利要求3所述的表达载体转化宿主细胞获得的。

5.亮氨酸脱氢酶的制备方法,其特征在于,在营养培养基中培养权利要求4所述的重组菌,收集具有亮氨酸脱氢酶活性的多肽。

6.根据权利要求5所述的亮氨酸脱氢酶的制备方法,其特征在于:所述的重组菌的构建方法为:将亮氨酸脱氢酶基因连接到表达质粒载体pET22b上,得到包含亮氨酸脱氢酶基因的重组质粒pET22b-LeuDH,然后将重组质粒pET22b-LeuDH转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,得到重组菌E.coli BL21-pET22b-LeuDH。

7.根据权利要求6所述的亮氨酸脱氢酶的制备方法,其特征在于:将重组菌E.coliBL21-pET22b-LeuDH在含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中37℃振荡培养10小时;按1% (v/v)的接种量吸取培养液转接到含100μg/mL氨苄青霉素的自诱导液体培养基中30℃进行培养;待OD600nm达到1.0后25℃低温培养6~12小时,离心收集菌液,弃上清培养基,用pH=8的PBS缓冲等体积洗涤三次,加入PBS缓冲使得重悬菌液OD600nm达到20,混匀;用超声破碎仪破碎,10000rpm离心10min取上清粗酶液;粗酶液用0.22μm膜过滤除去杂质,再采用亲和的介质填充层析柱镍柱对重组蛋白进行纯化,得到亮氨酸脱氢酶。

8.根据权利要求6所述的亮氨酸脱氢酶的制备方法,其特征在于:制备得到的亮氨酸脱氢酶,在25℃,pH10条件下比酶活为182.62U/mg;在60℃,pH10条件下比酶活为326.63U/mg。

9.根据权利要求7所述的亮氨酸脱氢酶的制备方法,其特征在于:所述自诱导液体培养基配方为:蛋白胨15g/L,酵母粉25 g/L,氯化钠10 g/L,葡萄糖2 g/L,乳糖3 g/L。

10.权利要求1所述的亮氨酸脱氢酶在制备L型氨基酸中的应用。

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