[发明专利]一种基于PCR制备粘性未端DNA组装产物的方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种基于PCR制备粘性未端DNA组装产物的方法。

背景技术

将两个或更多DNA片段按照设计组装在一起一直是生物学研究中非常基础且重要的一步。在启动子和外显子功能研究、蛋白质功能研究以及基因操作等传统领域中DNA连接技术都有广泛的应用。而在合成生物学这门新兴学科中，DNA连接更是成为许多研究必不可少的核心步骤。尽管一系列相关手段已经被开发出来，其中包括经典的typeⅡ型限制酶技术及同源重组技术等，他们都旨在获得更高的效率、准确度、适用性和通量，但直到现在，DNA连接技术仍然在平末端片段连接、一次性连接数量、连接长度、酶切位点依赖以及片段处理方面有着诸多限制，依然有很大的改进余地。本发明开发的一种新型DNA连接技术，在插入大片段的定点突变、载体构建、敲除基因片段以及嵌合编码序列上具有独特的优势。

发明内容

本发明旨在提供一种基于PCR制备粘性未端DNA组装产物的方法，利用PCR方法产生长短不一样的PCR产物，把PCR产物经过变性 和复性过程，就可形成粘性未端的可连接低物。

本发明具体通过以下技术方案实现：

一种基于PCR制备粘性未端DNA组装产物的方法，通过两对PCR扩增引物进行扩增，将两种产物混合在一起，高温条件下将PCR产物变性为单链DNA，在99℃条件下缓慢复性30s，形成具有粘性未端的DNA组装产物，在连接酶作用下，具有粘性未端的DNA组装产物之间进行组装。

所述的连接酶为T7连接酶，反应条件为：1X T7DNA连接酶反应缓冲液[66mM Tris-HCl，1mM ATP，10mM MgCl₂，1mM DTT，7.5％PEG 6000(pH 7.625℃)]，25℃温育。

本发明所述的两对PCR扩增引物所扩增的目标序列一样，但组装端的引物比另一条引物多出1个或1个以上碱基。

本发明组装端的引物5’末端进行磷酸化修饰或不经修饰，所述的引物扩增后产物利用DNA激酶作用使5’末端带有磷酸基团。

本发明的有益效果为：由于双链粘性未端是通过PCR方法产生，与传统内切酶方法相比，可以不需要内切酶的使用，因此，对序列是无特殊要求，可应用于任何核酸序列的组装，该方法按采用常规的分子生物学方法进行，所需要的试剂和仪器均为常用，无需特殊购买。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发 明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。

实施例1

一种基于PCR制备粘性未端DNA组装产物的方法，BDNF基因第100-106氨基酸序列删除突变，已知BDNF的蛋白编码区序列如SEQ IDNO.1。其中要删除序列为：GAGCTTTGTGTGGACCCTGAG。具体通过以下方法：

1)用Trizol法提取大鼠VTA区总RNA。

2)利用反转录引物T(18)(因绝大多数真核细胞mRNA 3’端具有Poly(A)尾，Oligo(dT)与其配对，仅mRNA可被反转录)及反转录试剂盒，把RNA转为cDNA。

3)在PCR反应体系中加入cDNA,以及表1所示引物组合(PCR反应体系为高保真聚合酶的常规PCR反应)：bdnf1和bdnf2；bdnf 1和bdnf3；bdnf4和bdnf6；bdnf5和bdnf6；进行30个循环扩增，分别得到扩增产物1，扩增产物2，扩增产物3，扩增产物4。

4)把扩增产物1和扩增产物2，以及扩增产物3和扩增产物4分别混合在一起，经过纯化，然后把产物加热到99℃进行变性处理，缓慢降低温度，完成复性过程。

5)把复性产物再一次混合，在DNA连接酶(T7连接酶，反应体系如上所述)作用下可完成制备BDNF基因突变体。 

表1引物序列(见序列表1：bdnf1,bdnf2,bdnf3,bdnf4,bdnf5,bdnf6)