[发明专利]一种仿生siRNA胶束纳米复合物及应用

说明书

本发明公开了一种仿生siRNA胶束纳米复合物及其制备方法，包括活性成分壳聚糖、阳离子材料、疏水长链烷烃、靶向配体和穿内涵体小肽，所述的复合物为以壳聚糖为骨架，阳离子材料和疏水长链烷烃为核心，靶向配体和穿内涵体小肽通过PEG、腙键共价修饰的仿生型siRNA胶束纳米载体。该siRNA胶束纳米载体充分利用阳离子聚合物易于修饰的优点，制备出具有肿瘤靶向、内涵体逃逸、胞内触发释放、长循环、高效稳定等多种性能的仿生型非病毒基因载体。

技术领域

本发明属于生物医学领域，具体涉及一种仿生siRNA胶束纳米复合物及其制备方法。

背景技术

病毒是目前基因治疗领域应用最多的一种核酸药物载体，其转染效率高，但存在着制备困难、目的基因容量小、靶向特异性差，以及生物安全性等问题。特别是1998年美国宾州大学人类基因治疗中心发生一例使用腺病毒基因治疗导致死亡的病例后，人们对人体内使用病毒载体的安全性提出了质疑。尽管如此，病毒载体细胞外稳定存在，细胞内解组装且动态转染的特点依然为人工合成非病毒基因载体的设计提供了很好的启示。依据仿生原理，人工合成的非病毒基因载体也可以通过组装功能基团，响应外界环境的刺激，改变自身的空间构象，达到类似病毒的动态、精密、高效的转染效果。

但到目前为止，非病毒基因载体的制备还存在以下几方面的问题：

1)大多数的非病毒载体的基因沉默效果较差，这主要与其进入细胞后依然被包埋在内涵体内，无法将siRNA释放到RNAi机制发挥作用的细胞质中有关，这也是siRNA有效传递的主要瓶颈。

2)大多数的非病毒siRNA载体的稳定性差，siRNA不能很好地被保护，在生物体内仍容易被核酶(RNase)降解、半衰期短。

3)大多数的非病毒基因载体带正电荷，这大大增加了载体的生物毒性，不利于体内的应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具备主动靶向、内涵体逃逸、触发释药、长循环、安全稳定等多种性能的仿生型siRNA胶束纳米复合物。

本发明具体通过以下技术方案实现：

一种仿生siRNA胶束纳米复合物，包括活性成分壳聚糖、阳离子材料、疏水长链烷烃、靶向配体和穿内涵体小肽，所述的复合物为以壳聚糖为骨架，阳离子材料和疏水长链烷烃为核心，靶向配体和穿内涵体小肽通过PEG、腙键共价修饰的仿生型siRNA胶束纳米载体。该siRNA胶束纳米载体充分利用阳离子聚合物易于修饰的优点，制备出具有肿瘤靶向、内涵体逃逸、胞内触发释放、长循环、高效稳定等多种性能的仿生型非病毒基因载体。

所述的壳聚糖的分子量优选50000～200000；所述的阳离子材料优选精氨酸(Arginine，Arg)、组氨酸(Histidine，His)、赖氨酸(Lysine，Lys)带正电荷的氨基酸；所述的靶向配体优选脱氧氨基葡萄糖(DG)、叶酸(FA)、精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽(RGD)或表皮细胞生长因子(EGF)；所述的PEG的分子量优选1500～10000；所述的疏水长链烷烃优选正丁醛、己醛、辛醛、癸醛或十二烷基醛；所述的具有内涵体逃逸功能的小肽优选HA2、L2、蜂毒肽(Melittin，MEL)、E5。

本发明siRNA胶束纳米复合物通过以下方法制备：

1)胶束亲水外壳的构建：

1.1壳聚糖骨架上修饰羧基：将邻苯二甲酸酐溶于DMF/H₂O溶液中，搅拌后加入将壳聚糖，加热反应得到氨基保护的壳聚糖，与溴代乙酸乙酯反应。

1.2PEG-配体复合物的制备：一端带有CHO的PEG与肿瘤靶向配体采用DCC/NHS体系进行催化羧基，形成酰胺键，得到CHO-PEG-配体的复合物进一步与水合肼反应，得到含腙键的PEG-配体复合物。