[发明专利]一株产β-半乳糖苷酶菌株及其制备高纯度低聚半乳糖的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种低聚半乳糖的制备方法，具体是利用重组亮白曲霉β-半乳糖苷酶基因的毕赤酵母菌株产β-半乳糖苷酶来催化合成低聚半乳糖的生产方法，属于微生物技术领域。

背景技术

低聚半乳糖(Galactooligosaccharides,GOS)具有低甜度、低热量、低致龋齿性、热酸稳定及食品安全性等特殊的性质，是人体肠道中双歧杆菌、嗜酸乳酸杆菌等有益菌极好的营养源和有效的增殖因子。它可以改善人体肠道的消化吸收功能，常作为一种新型的功能性食品添加剂，被称为食疗效果最好的“双歧因子”。2008年9月，根据《中华人民共和国食品卫生法》和《新资源食品管理办法》的规定，批准GOS为新资源食品。如今已被广泛应用于食品、保健品、乳制品、医药、饮料、饲料等各个行业，其生产应用具有巨大的市场前景。

工业上一般采用米曲霉、脆壁克鲁维酵母等生产低聚半乳糖。GOS初始生成的浓度多为30％左右，为了得到高纯度的GOS，需要对GOS进行分离纯化。其方法包括色谱柱法、纳滤膜法、酶法和微生物发酵法。其中微生物发酵法操作简单，成本较低，其原理是利用微生物需代谢单糖或乳糖来得到生长的能量，从而将杂糖成分去除来达到纯化的目的。现有技术中，专利文献报道了不同菌种产的β-半乳糖苷酶催化合成GOS，江波等人利用费式志贺菌产的β-半乳糖苷酶制备低聚半乳糖，产率达到44.5％；西班牙的Rodriguez-Colinas B等人利用来自乳酸克鲁维酵母的β-半乳糖苷酶来催化合成低聚半乳糖，酵母细胞用乙醇处理后冻干，得到低聚半乳糖的最大产率为44％。对于GOS混合液中的单糖组分，有专利利用酵母等发酵消耗其中的葡萄糖，但是对半乳糖和乳糖没有进行很好的分离。同时，我国从20世纪90年代开始对GOS进行工业化研究，但高纯度的GOS还没有实现工业化生产。

发明内容

为克服现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种产β-半乳糖苷酶基因的毕赤酵母菌株。本发明同时提供了一种应用上述菌株产的β-半乳糖苷酶催化高浓度乳糖水解和转苷，合成GOS的生产方法。

本发明所述的产β-半乳糖苷酶的菌株为毕赤酵母(pichia pastoris)SMD1168H-pGAZaA-lac，该菌株是将自亮白曲霉菌体中克隆到的β-半乳糖苷酶基因通过基因工程手段转化入毕赤酵母SMD1168H中，得到的高产β-半乳糖苷酶的毕赤酵母菌株。该菌株 于2013年10月17日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，菌种保藏编号为CGMCC No.8349。

本发明利用上述菌株制备高纯度低聚半乳糖的方法，其特征是，(一)利用毕赤酵母菌株SMD1168H-pGAZaA-lac制备β-半乳糖苷酶；(二)β-半乳糖苷酶催化乳糖合成低聚半乳糖；(三)通过马克斯克鲁维酵母纯化低聚半乳糖混合液；(四)精制得到高纯度的低聚半乳糖。

进一步的，所述(一)利用毕赤酵母菌株SMD1168H-pGAZaA-lac制备β-半乳糖苷酶，具体包括以下步骤：

(1)将毕赤酵母菌株SMD1168H-pGAZaA-lac接种于种子培养基中，于28-30℃条件下培养12-24h，得到种子液；

(2)将步骤(1)的种子液按质量比5-10％的接种量转接到发酵培养基中，在28-30℃，压力0.1-0.2MPa，溶氧0.1％-20％条件下，培养48-96h，得发酵液；

(3)将步骤(2)的发酵液离心，上清液即为β-半乳糖苷酶粗酶液；

(4)将步骤(3)的粗酶液超滤浓缩、冷冻干燥得到β-半乳糖苷酶的粉末。

其中，所述步骤(1)中的种子培养基成分如下：酵母粉1-10g/L，蛋白胨1-20g/L，葡萄糖5-20g/L；所述步骤(2)中的发酵培养基成分如下：KH₂PO₄ 5-20g/L，CaCl₂ 0.5-0.93g/L，MgSO₄ 1-15g/L，甘油5-20g/L，葡萄糖5-20g/L。

进一步的，所述(二)β-半乳糖苷酶催化乳糖合成低聚半乳糖，具体包括以下步骤：

(1)将冻干后的β-半乳糖苷酶粉末加入到浓度为200-450g/L的乳糖溶液中，得混合液；所述β-半乳糖苷酶的加入量为每克乳糖10-80U；

(2)将步骤(1)制得的混合液在30-45℃的条件下反应20-48h，得低聚半乳糖粗液。