[发明专利]一种荧光探针及其制备方法、应用

说明书

技术领域

本发明涉及化学领域，特别涉及一种荧光探针及其制备方法、应用。

背景技术

β-半乳糖苷酶是能够催化乳糖水解为半乳糖和葡萄糖的酶，在肾近曲小管上皮细胞中含量较高。医学上，尿中β-半乳糖苷酶活性可反映肾实质，特别是肾小管的早期损伤。实验室研究中，β-半乳糖苷酶基因(lacZ)常作为报告基因，通过检测β-半乳糖苷酶的表达水平来监测目的基因的表达情况。因此，β-半乳糖苷酶的检测具有重要意义。

目前比较成熟的方法是通过光度法检测。其检测的显色底物包含对-硝基苯基-β-D-半乳糖苷(Biochemical，1960，209)、4-甲基扇形酮基-β-D-半乳糖苷(J Organ Chem，1962，27，1074)、氯酚红基-β-D-半乳糖苷等。光度法检测存在灵敏度低，操作流程复杂等缺点。科研工作者在实验室研究中对细胞中β-半乳糖苷酶检测灵敏度、操作便捷性、检测效果要求较高，常用的分光度法不能很好的满足这些要求。通过荧光检测探针能够很好的满足实验室研究的需求。

β-半乳糖苷酶荧光检测探针的基本原理主要是荧光发色团和半乳糖通过糖苷键结合，在β-半乳糖苷酶作用下将糖苷键切断，荧光发色团的结构发生变化从而产生荧光的变化。通过检测荧光的变化来定性和定量的检测β-半乳糖苷酶。Ralp将DDAO(7-hydroxy-9H-(1,3-dichloro-9,9-dimethylacridin-2-one))荧光染料和半乳糖链接，发现在加入β-半乳糖苷酶后，最大发射波长红移了近50nm，加入荧光探针后，在表达lacZ基因的细胞里和阴性对照细胞有明显的荧光变化(CANCER RESEARCH，2004，64，1579–1583)。Helen合成了基于萤火虫荧光素的荧光探针，在lacZ基因和萤火虫荧光素基因双表达的细胞里加入荧光探针后，发现荧光强度和β-半乳糖苷酶的量成正相关的关系(NATURE METHODS，2006,3，295-301)。Tetsuo Nagano合成了基于荧光共振能量转移的β-半乳糖苷酶荧光探针，在加入酶前后荧光由绿色变成蓝色 (J.AM.CHEM.SOC.2006,128,15946-15947)。

现有一些已经商业化生产的荧光探针，其中有一些品牌AAT Fluorimetric Beta-Galactosidase Assay Kit*Green Fluorescence*， MUGβ-Galactosidase Assay Kit*Fluorimetric*，Beta Galactosidase Detection试剂盒(Fluorometric)等，美国生命技术(Life technologies)公司生产的Fluorescein Di-β-D-Galactopyranoside(FDG)售价达到5毫克3576元人民币。这些荧光探针存在的一个很大的问题就是合成复杂，需要极大的成本，所以售价居高不下。另一个问题是荧光基团的水溶性太差，在正常细胞生理环境下溶解较难。这些因素限制了β-半乳糖苷酶荧光探针的广泛应用。

因此，通过较少的合成步骤，较低的成本制备效果较好的β-半乳糖苷酶荧光探针具有重要社会价值和经济效益。

脂酶，是一种催化脂类的酯键水解反应的水溶性酶，能够逐步的将甘油三酯水解成甘油和脂肪酸。脂肪酶存在于含有脂肪的动、植物和微生物(如霉菌、细菌等)组织中，已广泛应用于食品、医药、洗涤剂等行业。特别是在食品行业中得到了大量的应用，并逐渐成为食品领域中应用最为广泛的酶类之一。同时，在医学上血清脂肪酶活性测定可用于胰腺疾病诊断，特别是在急性胰腺炎时，发病后4～8h内血清脂肪酶活性升高，24h达峰值，一般持续8～14天。开发便捷灵敏的脂肪酶检测方法具有重要的意义。

常用的脂肪酶检测有以下几种方法。浊度测定法，在制作琼脂平板时加入脂肪酶的底物及有色指示剂。在琼脂平板上点上待测脂肪酶(打孔加样或滤纸片点样)在脂肪酶水解作用下加样点的周围出现透明圈(R.C.Lawrence，Nature,1967,213，1264-1265)pH测定法，基于脂肪酶水解释放脂肪酸导致反应液pH降低,采用pH电极监测，用标准NaOH进行滴定检测(Tietz NW，Clin Chem.,1989,35，1688-1693)。还有滴定法，免疫学方法(孙艳，江西医学检验,2002,20，382-384)，荧光检测方法等。