[发明专利]一种间充质干细胞的培养基及其大规模培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及干细胞领域，具体涉及一种间充质干细胞的培养基及其大规模培养方法。

背景技术

干细胞(stem cell)是一类具有自我复制能力(self-renewing)的多潜能细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层，间充质干细胞具有干细胞的共性，即自我更新、多向分化和归巢的能力。在特定的机体外分化环境下，能够诱导分化为神经、心脏、骨、软骨、脂肪、上皮等多种组织细胞，被认为是细胞治疗技术的最有希望的来源细胞之一，是近几年研究的热点。间充质干细胞作为重要的再生医学资源，在临床的疾病治疗领域将有非常重要的应用价值。

大量研究证实，间充质干细胞可以从骨髓分离得到，也存在于其他不同组织和脏器，如肌肉、脂肪组织、脐血、脐带、胎盘、血管等。但成体中的间充质干细胞会随着年龄的增加，含量也会逐渐降低，而且增殖和分化的能力也会相应的下降。所以，在临床应用上，需要克服间充质干细胞细胞数量少的技术瓶颈，研究一种可大规模培养间充质干细胞的方法，对分离得到的原代间充质干细胞进行高效扩增显得尤为重要。

目前，现有技术中没有较为成熟的关于间充质干细胞的大规模培养培养方法。在间充质干细胞的常规培养中，最常见的培养体系是采用DMEM/F12培养基加上体积比为10％的胎牛血清(FBS)进行间充质干细胞的体外培养与扩增，但是间充质干细胞在传到5代之后，细胞形态即发生了改变，部分细胞出现了老化现象。而且FBS虽然可为间充质干细胞提供一些必要的营养物质，但FBS属于动物源性物质，成分比较复杂，在临床应用上存在潜在的风险，也增加了细胞污染的几率。而且FBS是一种价格比较高的生物制品，在间充质干细胞的大规模培养中，无疑会大大增加生产的成本。

发明内容

有鉴于此，本发明目的在于针对现有技术存在的问题，提供一种间充质干细胞的培养基及其大规模培养方法，本发明所述培养基克服MSC在体外进行扩增培养时对FBS的依赖，避免FBS在临床应用上的潜在风险，降低细胞污染的几率，同时对MSC的扩增起到促进作用，延缓MSC在体外培养的老化速度。本发明所述间充质干细胞的大规模培养方法可获得大量高纯度间充质干细胞，且能保持间充质干细胞良好的干细胞特性，适用于所有类型MSC的大规模培养。

为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

一种间充质干细胞的培养基，包括无血清培养基和表皮细胞生长因子和血小板衍生因子，其中所述表皮细胞生长因子浓度为5ng/mL～10ng/mL，血小板衍生因子浓度为5ng/mL～10ng/mL。

本发明所述间充质干细胞的培养基在无血清培养基的基础上添加表皮细胞生长因子(EGF)和血小板衍生因子(PDGF)，低浓度的EGF与PDGF联合使用，可起到协同促进MSC的增殖作用，并延缓MSC在培养过程中的老化现象，使MSC在传到第10代以上时，仍可以保持较好的增殖及分化能力，保持原有的间充质干细胞特性。

在一些优选实施方案中，所述表皮细胞生长因子浓度为5ng/mL。

在一些优选实施方案中，所述血小板衍生因子浓度为5ng/mL。

在一些实施方案中，所述无血清培养基为lonza UltraCULTURE MEDIUM无血清培养基。

本发明还提供了一种间充质干细胞的大规模培养方法，取原代分离培养的P1代间充质干细胞，用间充质干细胞的培养基调整接种密度为2×10⁴/mL-3×10⁵/mL，置于5％CO₂、37℃培养箱培养，当细胞融合度达到80％～90％后记为P2代细胞，重复传代至P10代细胞；所述间充质干细胞的培养基包括无血清培养基和表皮细胞生长因子和血小板衍生因子，其中所述表皮细胞生长因子浓度为5ng/mL～10ng/mL，血小板衍生因子浓度为5ng/mL～10ng/mL。

本发明所述间充质干细胞的大规模培养方法，适用于所有类型MSC的大规模培养，所述间充质干细胞可以为骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、牙髓间充质干细胞或外周血间充质干细胞。

在一些实施方案中，所述无血清培养基为lonza UltraCULTURE MEDIUM无血清培养基。