[发明专利]一种甘氨酰-L-酪氨酸手性异构体的分离检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种甘氨酰-L-酪氨酸手性异构体的分离检测方法，属分析化学领域。

技术背景

甘氨酰-L-酪氨酸是酪氨酸的重要来源，是复方氨基酸(15)双肽(2)注射液中二肽组成之一，本品克服了酪氨酸在水中溶解度差的问题，丰富了氨基酸注射液的配方。其化学名为甘氨酰-L-酪氨酸二水合物，化学结构式如下：

从结构式中可以看出本品存在手性异构体，即甘氨酰-D-酪氨酸，采用专属性好的分析方法严格控制产品的光学纯度，并制定合理可行的手性异构体杂质限度，是甘氨酰-L-酪氨酸质量控制的重要部分，对促进临床应用的安全性和有效性具有重要的现实意义。目前，尚未检索到检测甘氨酰-L-酪氨酸异构体的相关文献报道。

参考《分析化学研究报告》2009年9月发表的《α-氨基酸在冠醚手性固定相上定量结构-对映体保留相关性的研究》及《分析化学研究报告》2006年11月发表的《D，L-α-氨基酸对映体在冠醚手性柱上的分离》可知，冠醚作为一类手性色谱固定相，常被用来识别具有-NH₂官能团的对映体，其独特的冠环结构对客体分子的选择性识别起着重要作用，冠醚类手性固定相对含有伯胺官能团的化合物显示出非常好的拆分效果；故选择采用冠醚手性柱对甘氨酰-L-酪氨酸中手性异构体进行分离研究。

本发明提供的以在硅胶表面涂敷有手性冠醚的冠醚手性柱为色谱柱，以高氯酸水溶液为流动相，检测分离甘氨酰-L-酪氨酸手性异构体的液相方法，填补了此项空白。

发明内容

本发明的目的在于提供一种精确的甘氨酰-L-酪氨酸手性异构体的高效液相色谱检测方法，该方法以硅胶表面涂敷有手性冠醚的冠醚手性柱为色谱柱，以高氯酸水溶液为流动相，实现甘氨酰-L-酪氨酸与其手性异构体的分离与定量。

为实现上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

色谱条件采用冠醚手性柱CR(+)或CR(+)，以pH1～2的高氯酸水溶液为流动相，必要时可加入不大于15％的甲醇，检测波长为210～230nm，流速为0.4～0.9ml/min，柱温25～40℃，进样体积为10～20μl。

测定法取甘氨酰-L-酪氨酸适量，精密称定，加流动相溶解并稀释制成每1ml约含0.5mg的溶液，作为供试品溶液；另取甘氨酰-D-酪氨酸对照品与甘氨酰-L-酪氨酸适量，精密称定，加流动相溶解并稀释制成每1ml约含0.5μg甘氨酰-D-酪氨酸和每1ml约含0.5mg甘氨酰-L-酪氨酸的溶液，作为系统适用性溶液。精密量取供试品溶液与系统适用性溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。供试品色谱图中，如有与甘氨酰-D-酪氨酸保留时间一致的色谱峰，其按峰面积归一化法不得过0.1％。

本发明提供的高效液相色谱检测法能够有效的分离测定甘氨酰-L-酪氨酸及其手性异构体。经试验：该方法的定量限为0.02％，可满足检测要求，在浓度0.0847～0.6355μg/ml范围内，R²为0.9992，Y轴截距在100％响应值2.91％，响应因子RSD为7.80，线性关系良好。该方法的灵敏度高，分离度良好，结果准确可靠，耐用性良好，可用于甘氨酰-L-酪氨酸中手性异构体控制。

附图说明：

图1实施例1系统适用性高效液相色谱图(pH1.3，流速0.7ml/min，柱温30℃)

图2实施例2系统适用性高效液相色谱图(pH1.2，流速0.8ml/min，柱温35℃)

图3实施例3系统适用性高效液相色谱图(pH1.1，流速0.9ml/min，柱温40℃)

具体实施方式

以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

(1)仪器与条件

色谱柱：冠醚手性柱(CR(+)，150×4.6mm，5.0μm)

流动相：pH1.3的高氯酸水溶液

检测波长：220nm

柱温：30℃

流速：0.7ml/min

进样体积：10μl

(2)实验步骤

系统适用性溶液：取甘氨酰-D-酪氨酸、甘氨酰-L-酪氨酸各适量，加流动相溶解并稀释制成每1ml约含甘氨酰-D-酪氨酸0.5μg、甘氨酰-L-酪氨酸0.5mg的溶液，