[发明专利]一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒纯化及其疫苗制备方法

说明书

本发明公开了一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒疫苗的制备方法和应用。本发明所提供的制备方法包括以下步骤：将人工优化的编码猪圆环病毒2型Cap蛋白的基因克隆到杆状病毒载体中，通过转染昆虫细胞sf9获得重组杆状病毒。利用重组杆状病毒感染high five细胞，使Cap蛋白在细胞中大量表达。本发明还公开了一种快速简便纯化病毒样颗粒的方法。本发明所提供的纯化方法包括以下步骤：离心收集high five细胞，以冰预冷PBS重悬细胞，使用细胞均质仪将细胞悬液裂解为较澄清的液体。通过凝胶过滤层析方法对病毒样颗粒进行纯化。使用本发明所提供的方法能够快速从复杂的细胞裂解液中特异的纯化到病毒样颗粒蛋白，纯度达到90％以上。

技术领域

本发明属于生物技术疫苗制备领域，具体涉及到一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒纯化及其疫苗制备方法。

背景技术

猪圆环病毒(Porcine Circovirus，PCV)属于圆环病毒科(circoviridae)圆环病毒属成员，是迄今为止发现的最小动物病毒。1974年，德国学者Tisch等首次在PK15(ATCC-CCL31)的细胞系培养基中发现了一种细胞污染物，分析表明该污染物为单链共价环状的无囊膜的二十面体对称的DNA病毒，并将其命名为猪圆环病毒(PCV)。该病毒虽然广泛传播，但是对猪群不具有致病性，也不引起临床症状和病理变化。随后研究人员在患有断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的猪中分离出了对猪具有致病性的PCV病毒，并将其命名为PCV2，而将之前不具有致病性的PCV命名为PCV1。

PCV2引起的疾病范围非常广泛，不但能够导致母猪出现繁殖障碍，还能够使断奶仔猪和育肥猪出现呼吸道疾病、猪皮炎肾病综合征(PDNS)、猪呼吸道疾病综合症(PRDC)、增生性坏死性肺炎(PNP)等相关疾病。所以，这些与PCV2相关的疾病被有些学者统称为猪圆环病毒病(PCVDS)。在养猪业蓬勃发展的中国PCV2感染情况相当普遍。据国内部分地区流行病学调查结果显示：PCV2一般感染率为26.03-77.46％，部分省份和地区抗体或病毒核酸阳性率高达100％。PCV2常与猪瘟、猪蓝耳病等病原混合感染，有证据显示PCV2感染使机体继发感染其他传染病的几率增加，这一现象可能是由于PCV2感染引起猪的免疫抑制所导致的。

自从加拿大首次发现PMWS以来，出现了一系列与PCV2相关的疾病和综合征。疫苗免疫被认为是针对这一病毒的主要防治手段。迄今为止，已注册上市的PCV2疫苗主要是灭活疫苗和亚单位疫苗。其中灭活疫苗由于不能在动物体内复制，因此对机体刺激时间比较短，如果想要获得持久免疫力就需要多次重复接种。

PCV2基因组含有11个开放阅读框(orf)，其中orf1与orf2是其最大的两个阅读框。现已证实，orf1编码与病毒复制相关的Rep蛋白，该蛋白氨基酸序列相当保守，是PCV1和PCV2产生抗原交叉性的主要原因；orf2编码的Cap蛋白是圆环病毒的结构蛋白，也是圆环病毒的主要抗原蛋白。由于亚单位疫苗具有产量高、纯度高、安全性好等优点，因此，Cap蛋白成为研制PCV2亚单位疫苗的明星抗原。至今为止，Cap蛋白在多种表达系统中均得到表达。由于杆状病毒表达系统具有宿主范围窄、极易灭活、对外源基因克隆容量大、具有完整的翻译后加工修饰系统等优势，因此，本发明采用昆虫杆状病毒表达系统表达猪圆环病毒2型的Cap蛋白。为了使其能够更加适应昆虫杆状病毒表达系统、提高其蛋白产量，本发明在不改变氨基酸序列的前提下对编码Cap蛋白的氨基酸密码子进行优化，经人工改造的Cap蛋白核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明显示，经过氨基酸密码子优化的Cap蛋白在昆虫细胞中高效大量表达，产量达到100mg/L。

Cap蛋白能够自我组装成为病毒样颗粒结构(VLPs)，目前，对于病毒样颗粒的纯化方案通常是使用蔗糖密度梯度离心的方式，但是采用这种方式存在耗时长、纯化效率低等缺点。为了解决上述问题，本发明提供了一种快速简便地从细胞裂解物中纯化病毒样颗粒的方案，采用本方案仅需要一步凝胶过滤层析即可得到纯度大于90％的病毒样颗粒，不但节省了大量时间还会因为简化纯化步骤从而减少蛋白在纯化中间环节中所造成的损失。

发明内容