[发明专利]基于上转换纳米晶的受激损耗超分辨光学显微方法及系统

说明书

技术领域

本发明涉及光学显微技术和光学纳米材料领域，特别涉及基于上转换纳米晶的受激损耗超分辨光学显微方法及系统。

背景技术

根据瑞丽/阿贝准则，光学系统能分辨的两个等亮度间的距离对应艾里斑的半径，艾里斑的大小可以用半高全宽(full-width at half-maximum,FWHM)来表示为：

Δr=0.61λNA]]>

其中λ为入射光波长，NA为透镜数值孔径，那么，常规的光学系统的极限分辨率大小在半波长范围。

受激发射损耗显微术(STimulated Emission Depletion Microscopy，STED)是一种利用荧光饱和与激发态荧光受激损耗的非线性关系的超分辨成像方法。STED显微术包括两束激光，一束为激发光，另一束为损耗光；激发光激发荧光物质发出荧光，损耗光为经相位调制后得到的空心光束，通过将激发光斑中心以外部分的荧光分子通过受激辐射原理强行淬灭回基态，从而直接减小自发荧光点扩散函数的半高宽，突破衍射极限实现超分辨。上述表述中的激发光一般为飞秒脉冲激光或连续(CW)激光，损耗光一般为高功率的激光(比如，飞秒脉冲激光或者大功率CW激光)，由于使用脉冲激光器需要一系列复杂昂贵的元器件，而且激发光、损耗光、探测荧光波长间隔很小，因此此类装置具有成本投入高的缺点。

上转换纳米颗粒(UCNPs)是一种在纳米晶(如NaYF₄和Y₂O₃等)中掺杂稀土离子(如Er³⁺，Tm³⁺，Ho³⁺，Nd³⁺和Yb³⁺等)的复合型纳米材料，具有以下的优势：(1)可以使用近红外光激发而不是紫外光，有利于减少生物损伤，增大激发光穿透深度；(2)多光子上转换发光过程基于真实的电子能级，比传统双、多光子染料发光效率更高，可以使用低功率照射(如：CW激光器)获得多光子激发光强，饱和激发功率低；(3)无光漂白、无光闪烁、稳定性好，且荧光寿命长，发射光谱谱线窄；(4)激发光谱与发光光谱波长间隔大，没有重叠。

根据以上表述，结合材料优势，利用低功率的连续激光器探寻出一种成本较低的基于多光子STED的超分辨成像方法，对生命科学、医学研究、材料表征测试等领域的应用有重要的意义。

发明内容

本发明的一个目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种基于上转换纳米晶的受激发射损耗超分辨光学显微方法，该方法相对于传统受激损耗方法，是多光子成像过程，结果具有更高分辨率。

本发明的另一个目的在于提供一种实现上述基于上转换纳米晶的受激损耗超分辨光学显微方法的显微成像系统，该系统利用稳态激光器，利用上转换材料的性质优势，实现多光子激发过程，从而实现半导体稳态激光器激发多光子受激损耗，价格低廉，搭建方便，易于推广。

本发明的目的通过以下的技术方案实现：基于上转换纳米晶的受激损耗超分辨光学显微方法，包括以下步骤：

(1)第一连续激光器产生稳态激光束，经空间相位调制后形成空心光束，该空心光束用作损耗光；

(2)第二连续激光器产生近红外稳态激光束，该光束用作激发光；其中，第二连续激光器的波长处于近红外波段，第一连续激光器的波长短于第二连续激光器的波长，所述第一连续激光器的中心波长匹配UCNPs的发光光谱，所述第二连续激光器的波长匹配UCNPs的激发波长；

(3)将损耗光与激发光在空间上准直共轴耦合，并将耦合后的激光束聚焦在UCNPs本身或者被UCNPs荧光标记的样品上，使样品产生超分辨多光子荧光信号；

(4)利用光电探测器检测上述超分辨多光子荧光信号，进行XYZ方向扫描，得到荧光成像图片。

优选的，所述第二连续激光器的波长波段在700nm～1800nm之间。