[发明专利]一种苏禽黄鸡胚胎干细胞特定基因进行靶向敲除方法

说明书

技术领域：

本发明涉及干细胞工程领域，尤其涉及一种基于CRISPR/Cas9技术对苏禽黄鸡胚胎干细胞特定基因进行靶向敲除的方法。

技术背景：

目前基因组编辑技术主要有三种方法，锌指核酸酶(zinc finger endonuclease，ZFN)、类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription Activator-Like Effector Nuclease，TALEN)以及成簇的规律间隔的短回文重复序列及相关基因(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated，CRISPR/Cas)。这三种方法都通过在外源DAN靶位点上产生双链切口，从而诱导出同源重组修复和非同源末端连接，进而实现基因组的编辑。

ZFN结构上包括锌指蛋白(Zinc finger protein，ZFP)结构域和Fok I切割结构域，其中Fok I切割结构域源于一种IIS型限制性内切酶，当Fok I酶二聚体化，发挥其切割活性切割DNA的靶位点，形成双链断裂(double-stranded breaks，DSB)，从而诱导细胞内的修复机制，即同源重组修复(homology-directed repair，HDR)或非同源末端链接(non-homologous end-joining，NHEJ)，从而实现基因组的靶向敲除(knock-out)或敲入(knock-in)，然而ZFN目前还存在设计苦难、脱靶严重，技术垄断等问题；

而TALEN结构上包括TALE(transcription activator-like effector)结构域和Fok I核酸内切酶结构域两个部分，其作用机制与ZFN一致，目前也存在多项缺陷，例如成本高，可操作性难度大，细胞毒性等；

CRISPR/Cas系统中主要以典型的Type II CRISPR/Cas为主，结构上分为三个部分tracrRNA位于5’端，CRISPR序列位于3’端，中间的为一系列的Cas基因家族，其中Cas9为核心蛋白，因此可以称此II型系统为CRISPR/Cas9系统。当外源DNA序列进入细菌或古细菌的含有CRISPR的细胞中，CRISPR复合体中的类似于Cas1核酸结合蛋白会介导该复合体与外源DNA序列进行结合，然后该复合体中类似于Cas2核酸内切酶会对外源DNA序列进行切割，形成众多约17-84bp不均等的小片段，其中的一个片段会在相关蛋白的作用下被整合到CRISPR的前导序列和第一个重复序列之间，形成一个新的间隔序列，入侵者与间隔序列相同的序列称为protospacer。当外源DNA再次入侵时，与其protospacer互补匹配的间隔序列，及其两边的部分重复序列转录形成前体crRNA(pre-crRNA)。转录完成后，tracrRNA与pre-crRNA形成二聚体，再与Cas9蛋白结合形成核糖核蛋白复合物，与外源DNA结合，扫描、寻找靶序列，crRNA的间隔序列与靶序列进行互补配对，在外源DNA互补配对的特定位置上被核蛋白复合物剪切。

CRISPR/Cas的打靶效率比较高，最高可达80％，且靶位点设计灵活、方便，载体构建简单；不同于ZFN或TALEN中以蛋白质识别DNA的方式，CRISPR/Cas系统对靶序列的识别是以RNA与DNA碱基配对的方式，这样会降低了脱靶的几率，降低了细胞毒性，但并不是代表不会产生；此外，较于ZFN与TALEN，CRISPR/Cas的设计更为简单、廉价，一般普通的实验也可自行操作；最后，CRISPR/Cas最大的有点就是可同时打靶多个基因，且每多一个靶位点只需多一个gRNA质粒。

有优势必然也会存在局限性，例如CRISPR/Cas技术目前还尚未成熟，需要设计出特异性较高的gRNA质粒，严重的脱靶效应以及在未建系的干细胞上无成功先例等，但相信随着CRISPR/Cas的发展，这些难题终将会被解决。

发明内容：