[发明专利]糖基化改造提高脂肪酶表达的方法、突变酶及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及糖基化改造提高脂肪酶表达的方法、突变酶及其应用，属于酶工程领域。

背景技术

米根霉脂肪酶具有良好的1,3-位置特异性，优先催化中长链脂肪酸，在食品、化工及生物能源等方面都有很重要的应用。利用酶的水解、合成及转酯等活性，米根霉脂肪酶有不同的应用。

目前，米根霉脂肪酶的全基因序列已经在NCBI上公布。该酶包括26个氨基酸信号序列(presequsece)、97个氨基酸前导肽序列(prosequsence)和269个氨基酸成熟肽序列(mROL)所组成。已有研究表明前导肽对米根霉脂肪酶的分泌和折叠起着十分重要的作用：酶的分泌必需有前序列的20号到37号残基，而经折叠形成活性脂肪酶必需有38号到57号残基。米根霉脂肪酶在大肠杆菌中有很好的表达，但这些脂肪酶只能以无活性的形式表达。

P.pastoris是应用广泛、最高效的外源蛋白表达工具之一，基因的特性、内质网中的蛋白质折叠、蛋白从内质网到高尔基体的转运以及蛋白的翻译等许多因素都能影响P.pastoris表达蛋白的水平。P.pastoris表达蛋白产生N-糖基化是一种常见情况，糖基化能够稳定蛋白质的成熟构象，影响蛋白的活性及热稳定性，以及对蛋白质的正确折叠、运输、定位也起着重要作用。其中N-糖基化在许多蛋白质研究报道中都有着至关重要的作用，对蛋白的分泌等作用是必需的，人们对其研究也相对深入。通常，蛋白质的功能发生改变往往是由于蛋白的结构发生了变化，而蛋白质上增加一个大的糖链能极大的改变蛋白质的结构。

据研究报道N-糖基化对P.pastoris表达蛋白的分泌水平与活性等具有重要影响。Kohno等构建表达Kex2位点突变脂肪酶的P.pastoris基因工程菌，发现前导肽未被处理的RNL的热稳定性更高，且结合到脂肪酶上的糖链长度大小对RNL的热稳定性无影响。Ito等研究卵清蛋白的N-糖基化对蛋白分泌量的影响，证明292位N-糖基化对该蛋白的分泌折叠是必须的。Boivin等研究N-糖基化对P.pastoris表达的溶栓剂DSPAα1分泌水平和活性的影响，结果发现该蛋白的两个位点的N-糖链(N117和N362)对蛋白的分泌和酶活性具有重要作用。此外，根毛霉脂肪酶的N-糖基化研究也证明其对酶的分泌有关键作用，但N-糖基化对其酶活的获得却有消极作用。

本发明通过对米根霉脂肪酶的前导肽进行N-糖基化突变，获得了酶活和表达量提高的脂肪酶突变体。

发明内容

为了克服现有米根霉脂肪酶表达量和酶活较低的缺陷，本发明提供一种基于N-糖基化改造提高脂肪酶表达的方法，以及表达提高的脂肪酶及其应用。

本发明的第一个目的是提供一种表达提高脂肪酶突变体。

所述突变体，是在米根霉脂肪酶的基础上，将其前导肽的SAS和/或NT氨基酸位点突变为N-糖基化位点。

所述突变体，在本发明的一种实施方式中，是将前导肽序列中的SAS氨基酸位点突变成N-糖基化位点NGT，命名为proROLA，突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述突变体，在本发明的一种实施方式中，是将前导肽序列中的NT氨基酸位点突变成N-糖基化位点NLT，命名为proROLB，突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述突变体，在本发明的一种实施方式中，是将前导肽序列中的SAS、NT氨基酸位点分别突变成N-糖基化位点NGT、NLT，命名为proROLAB，突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

所述突变体，还可以是在严格条件下(Tm－10～15℃)与SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示氨基酸序列杂交且编码具有脂肪酶活性的蛋白质分子。

所述米根霉脂肪酶，在本发明的一种实施方式中，发生N-糖基化突变前的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，由于不同米根霉菌株来源的脂肪酶氨基酸序列仅有个别氨基酸的差异，因此，该方法不仅适用于SEQ ID NO.4序列，而且对氨基酸序列相似性达到80％以上的脂肪酶序列均适用于本专利。

所述米根霉脂肪酶，在本发明的一种实施方式中，发生N-糖基化突变前的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

本发明的第二个目的是提供含有所述脂肪酶突变体的表达载体。

所述表达载体为分泌型载体。