[发明专利]一种电化学发光传感器及其免疫分析方法

说明书

技术领域

本发明涉及免疫学领域，具体涉及一种电化学发光传感器及其免疫分析方法。

背景技术

免疫分析法利用抗原抗体特异性结合反应检测各种物质，如药物、激素、蛋白质、微生物等的分析方法。在药物分析中，免疫分析法的应用主要集中在以下几方面：(1)在实验药物动力学和临床药物学中测定生物利用度和药物代谢动力学参数等生物药剂学中的重要数据，以便了解药物在体内的吸收、分解、代谢和排泄情况；(2)在药物的临床检测中，对治疗指数小、超过安全剂量易发生严重不良反应或最佳治疗浓度和毒性反应浓度有交叉的药物血液浓度进行监测；(3)在药物生产中从发酵液或细胞培养液中检测时间短测定有效组分的含量，以实现对生产过程的在线监测；(4)对药品中是否存在特定的微量有害杂质进行评价。

免疫分析可分为无标记(直接测定)和标记(间接测定)两种类型。相对标记免疫分析，无标记免疫分析技术能够直接测定生物样品，测定过程中无需预先对抗体或抗原进行标记，具有检测成本低，样品消耗少，耗费时间短，操作简单等显著优势，适应直接、实时、原位、在线的痕量免疫分析，因此引起了人们极大的研究兴趣，成为生物传感领域发展的一个非常重要方向。目前的无标 记型免疫分析主要分为光学免疫分析、压电免疫分析和电化学免疫分析。其中表面等离子共振免疫传感器、石英晶体微天平免疫传感器、电容免疫传感器及交流阻抗免疫传感器，文献中报道的较多。

目前，化学发光免疫分析技术在医学临床应用已成为研究热点，它同时具备了化学发光法的高灵敏度和免疫分析法的高特异性，具有灵敏度高、特异性强、无放射性危害、适用面广、设备简单、线性范围宽等分析优点，日益受到人们的青睐，在生命分析、临床诊断、环境监测、食品安全、药物分析等领域得到了广泛应用，并有取代放射免疫分析和酶联免疫分析成为诊断市场上的主流趋势，而无标记化学发光免疫分析鲜有报道。因此，发展灵敏、检测时间短、成本低和便捷的新型无标记化学发光免疫分析方法，将具有非常重要的科学意义。

目前，缺乏一种无标记的检测时间短的电化学发光传感器及其免疫分析方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种无标记的检测时间短的电化学发光传感器及其免疫分析方法。

本发明的技术方案如下：本发明提供了一种电化学发光传感器的制备方法，包括以下步骤：

(1)将石英玻璃片在HCL与H₂O₂的水溶液中浸泡10-12h，用蒸馏水充分清洗后，在氩气气氛中吹干，浸泡在1％的3-(2,3环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷GPTMS的甲苯溶液中进行硅烷化反应，在温度为22℃下放置20-24h；所述HCL与H₂O₂的体积比为8:4；

(2)用二甲苯和乙醇冲洗并在氩气气氛下吹干；

(3)将金纳米粒子溶液和5.0wt％聚葡萄糖胺(1-4)-2-氨基-B-D葡萄糖溶液混合后超声至完全分散，然后与化学发光探针、抗体溶液相混合；

(4)取上述混合溶液，将其滴涂到石英玻璃片表面，并在温度为22℃下反应2-3h，然后在10℃下放置10-12h；

化学发光探针为葡萄糖氧化酶或辣根过氧化物酶；所述抗体溶液为人类免疫球蛋白HIgG抗体溶液或甲胎蛋白AFP抗体溶液；所述葡萄糖氧化酶或辣根过氧化物酶的浓度为6μg/ml，人类免疫球蛋白HIgG抗体溶液浓度为50μg/ml；

(5)用磷酸盐缓冲液和烷基酚聚氧乙烯醚冲洗五次，并在10℃下用封闭液封闭15-20h，所述封闭液为含1％牛血清白蛋白的0.01M磷酸盐缓冲液，pH为7.3；制得电化学发光免疫传感器。

进一步地，在步骤(5)中，磷酸盐缓冲溶液是每0.325-2.469g Na₂HPO₄·12H₂O加0.058-0.956g NaH₂PO₄·2H₂O在300ml的容量瓶中定容制得。

本发明的方法制得的电化学发光传感器的免疫分析方法，包括如下步骤：

(1)将所述免疫传感器固定在免疫微反应器后，将带抗原样品以0.6ml/min的速度注入流通池，在线温育后形成免疫复合物；所述在线温育时间为18-26min；

(2)用缓冲液PBST以1ml/min的速度冲洗免疫复合物，除去未反应的免疫试剂；

(3)将化学发光底物溶液以0.5ml/min的速度通入免疫传感器，产生的化学发光信号由光电倍增管记录。