[发明专利]一种戊型肝炎病毒样颗粒疫苗的制备方法及其应用

说明书

本发明公开了一种戊型肝炎病毒样颗粒疫苗的制备方法，属于生物医药技术领域。本发明对戊型肝炎病毒截断衣壳蛋白基因进行了密码子优化，采用原核表达系统的大肠杆菌菌株B834‑pRARE2，通过融合了纯化标签MBP表达、不同裂解剂进行筛选和组合，细菌膜抽提、麦芽糖直链淀粉亲和层析、分子筛层析除去MBP和非病毒结构蛋白，并促使病毒样颗粒的组装，使戊型肝炎病毒样颗粒纯度达99.0％以上，且没有有任何蛋白标签并具有生物活性(非包涵体形式，可溶性)。本发明戊型肝炎病毒样颗粒疫苗对猪、犬、鸡HEV感染产生完全保护，不同基因型HEV病毒之间有交叉保护性抗原。在动物上可作为一种疫苗，预防猪、犬、禽HEV引起的疾病和感染。

技术领域

本发明涉及一种疏水性病毒衣壳蛋白的制备方法及其应用，特别涉及一种戊型肝炎病毒样颗粒疫苗的制备方法及其应用，属于生物医药技术领域。

背景技术

戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus，HEV)是肝炎病毒科肝病毒属成员之一，含一正向单链RNA，基因组有3个重叠开放阅读框架(ORFs)，包括ORF1、ORF2、ORF3。病毒分为4种基因型，基因I型和基因II型病毒主要从人体分离，基因III型、基因IV型病毒主要来源于猪、鸡、兔、犬等动物，甚至有基因V型病毒发现。基因I型病毒主要在中国以及东南亚流行，HEV是急性肝炎的主要病原，引起中度、严重肝炎，严重程度随年龄增加。

HEV在许多发展中国家流行，特别是南亚、东南亚、北非、中东地区，流行病学调查全球有1/3人感染。HEV通过饮用污染水源的粪口途径传播。普通人感染的死亡率1-15％，但对怀孕妇女引起致死急性感染，死亡率高达30％，感染存活的怀孕妇女发生高概率流产、早产。对慢性肝炎病人，HEV二次感染导致严重后果。所以HEV是严重威胁公共卫生的疾病，快速的诊断和预防HEV是非常有必要的。

人的戊型肝炎尽管在普通人群中发病率小于1％，但在发展中国家或卫生条件不好的地区，因为污染的水源大规模急性戊型肝炎经常发生，发达国家也有食品污染散发流行。截至目前，已经鉴定和确定4个基因型HEV病毒，基因I型、基因II型病毒只在人群传播，而基因III型、基因IV型病毒在动物之间传播，甚至发现了在野猪和大鼠中流行基因V型、基因VI型戊型肝炎病毒。所有已经辨明的猪戊型肝炎病毒属于基因III型或基因IV型病毒，可跨种属间的屏障传播，其他动物犬、兔的HEV也能感染猪。人的动物源性戊型肝炎病毒感染经常多发生于消费了污染的猪肝、猪肉、鹿肉或其他污染传染性HEV的肉制品或水。

鸡戊型肝炎病毒引起肝炎脾肿大综合症(hepatitis splenomegaly syndrome(HSsyndrome))，引起30-72周的蛋鸡卵巢萎缩，肝脾肿大、腹腔大量红色积液。禽HEV的基因组基因测序显示禽HEV基因组结构和哺乳动物相似，核苷酸序列有50％的同源性，与人HEV和猪HEV基因结构和功能相似。禽HEV的衣壳蛋白和哺乳动物有共同的抗原性和抗原表位。美州的禽HEV、欧洲禽HEV、东南亚分离的禽HEV的核苷酸同源性达80％，应属于肝炎病毒不同的属，其他人、猪、犬HEV为肝炎病毒科不同肝炎病毒属。

60周龄的SPF鸡静脉注射5×10^4.5 50％禽感染剂量，引起HS综合症，有淋巴细胞lymphocytic periphlebitis和phlebitis为特征的肝损伤，约有25％感染的鸡有subcapsular出血或肝右中叶肥大现象，浆肝酶乳糖脱氢酶轻微上升(the plasmaliverenzyme lactate dehydrogenase)。禽HEV的致病性的发现给HEV致病和免疫的研究提供了小个体动物模型，同时也为HEV疫苗的评估和研究提供了平台，特别是疫苗对HS综合症的防控效果。

一般地，健康鸡感染HEV有抗体产生，显示为亚临床症状。从HS的鸡和健康鸡的分离的病毒核苷酸的同源性为91％，其致病性不同，因此疫苗对不同HEV的毒株的保护性不同，实例强调了对禽不同致病性的毒株的保护效果。